多重RNA向导的基因组工程制造技术

本发明专利技术提供了多重RNA向导的基因组工程。具体提供了将外源核酸序列多重插入表达Cas9酶的细胞中的DNA内的方法，所述酶同与靶DNA互补的向导RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：(a)将多种向导RNA和多种外源供体核酸序列引入至所述细胞中，其中所述多种向导RNA与所述靶DNA的不同位点互补，其中所述多种RNA中的各向导RNA和所述Cas9酶是与所述靶DNA的共定位复合物的成员，以及(b)重复步骤(a)以在所述细胞中对于所述DNA产生多种外源核酸的插入。述DNA产生多种外源核酸的插入。述DNA产生多种外源核酸的插入。

【技术实现步骤摘要】
多重RNA向导的基因组工程


[0001]本申请属于基因工程领域，具体涉及多重RNA向导的基因组工程。

技术介绍

[0002]细菌和古细菌CRISPR
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Cas体系(system)凭借短的向导RNA形成Cas蛋白复合物以指导存在于侵入的外来核酸内的互补序列的降解。参见Deltcheva，E.et al.CRISPR RNA maturation by trans
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encoded small RNA and host factor RNase III.Nature 471，602
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607(2011)；Gasiunas,G，Barrangou,R.，Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9
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crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.proceedings of the National Academy of Sciences 109,E2579
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2586(2012)；Jinek,M.et al.Aprogrammable dual
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RNA
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guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337,816
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821(2012)；Sapranauskas,R.et al.The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli.Nucleic acids research 39,9275
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9282(2011)；以及Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR
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Cas systems in bacteria and archaea:versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.Annual review of genetics 45,273
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297(2011)。最近化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR体系的体外重构(reconstitution)证实了融合至正常反式编码的tracrRNA(“反式激活的CRISPR RNA”)的crRNA(“CRISPR RNA”)足以指导Cas9蛋白序列特异地切割匹配该crRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9募集(recruitment)和靶DNA的降解。参见H.Deveau etal.,Phage response to CRISPR
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encoded resistance in Streptococcus thermophilus.Journal of Bacteriology 190,1390(Feb,2008)。

技术实现思路

[0003]本公开内容的方面旨在使用一种或多种x向导RNA(核糖核酸)多重修饰在细胞中的DNA以指导由细胞表达的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA结合蛋白，至该DNA(脱氧核糖核酸)上的靶位置(target location)，其中，该酶剪切DNA并且使外源供体核酸插入至该DNA中，如通过同源重组。本公开内容的方面包括在细胞上循环或者重复DNA修饰步骤以生成在细胞内具有多重DNA修饰(modification)的细胞。修饰可以包括外源供体核酸的插入。
[0004]通过引入编码多个RNA以及多个外源供体核酸的核酸至表达酶的细胞，如通过共转化(co
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transformation)，的单一步骤，可以实现将多重外源核酸插入，其中表达该RNA并且其中在多个RNA中的每一个向导该酶至DNA的特定位点，该酶剪切DNA并且将多个外源核酸中的一个插入至在此剪切位点处的DNA。根据这个方面，在单一循环中产生了在细胞中的DNA的多种改变(alteration)或修饰。
[0005]通过引入编码一种或多种RNA或多个RNA以及一种或多种外源核酸或多个外源核
酸的一种或多种核酸至表达酶的细胞的重复步骤或循环，可以实现将多重外源核酸插入至细胞中，其中表达RNA并且向导该酶至DNA的特定位点，该酶剪切该DNA并且将外源核酸插入至在此剪切位点处的DNA，以使产生具有多重改变或具有外源DNA插入至在细胞内的DNA的细胞。根据一个方面，表达酶的细胞可以是表达天然的酶的细胞或者已经遗传地改变以表达酶(如通过引入编码该酶的核酸至细胞并且由该细胞可以将其表达)的细胞。以这样的方式，本公开内容的方面包括循环以下步骤：将RNA引入至表达酶的细胞，将外源供体核酸引入至细胞，表达该RNA，形成该RNA、该酶和DNA的共定位复合物(co
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localization complex)，通过酶酶促地剪切DNA，以及将供体核酸插入至该DNA。循环或者重复以上步骤导致在多重基因座(loci)处的细胞的多重遗传(genetic)修饰，即，具有多重遗传修饰的细胞。
[0006]根据某些方面，通过循环以上描述的方法提供了增加同源重组率的方法。在一种实施方式中，基因组Cas9指导的DNA剪切经由戏剧性地提高同源重组率刺激了外源DNA。根据某些另外的方面，外源供体核酸包含同源序列(homology sequences)或者侧接剪切位点的臂(arms flanking the cut site)。根据某些另外的方面，外源供体核酸包括除去剪切序列的序列。根据某些另外的方面，外源供体核酸包括同源序列或者侧接剪切位点的臂以及除去剪切位点的序列。以这样的方式，Cas9可以用作为针对不包含外源供体DNA的细胞的阴性选择(negative selection)。因此，提供了用于鉴别具有高重组频率的细胞的阴性选择的方法。
[0007]根据某些方面，在本公开内容的范围内的DNA结合蛋白或者酶包括与向导RNA形成复合物并且与gRNA一起向导复合物至双链DNA序列(其中该复合物结合至DNA序列)的蛋白。根据一个方面，该酶可以是RNA向导的DNA结合蛋白，如结合至DNA并且由RNA向导的II型CRISPR体系的RNA向导的DNA结合蛋白。根据一个方面，RNA向导的DNA结合蛋白是Cas9蛋白。
[0008]本公开内容的这个方面可以被称作为RNA与DNA结合蛋白的共定位至双链DNA或与双链DNA一起共定位。以这样的方式，DNA结合蛋白
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向导RNA复合物可以用于剪切双链DNA的多重位点以便生成具有多重遗传修饰，如外源供体DNA的多重插入的细胞。
[0009]根据某些方面，提供了一种在表达酶的细胞中进行对于靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将外源核酸序列多重插入表达Cas9酶的细胞中的DNA内的方法，所述酶同与靶DNA互补的向导RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：(a)将多种向导RNA和多种外源供体核酸序列引入至所述细胞中，其中所述多种向导RNA与所述靶DNA的不同位点互补，其中所述多种RNA中的各向导RNA和所述Cas9酶是与所述靶DNA的共定位复合物的成员，其中，所述Cas9酶切割所述DNA以产生切割位点，并且将所述多种外源供体核酸序列中的一种插入至所述DNA中，以及(b)重复步骤(a)以在所述细胞中对于所述DNA产生多种外源核酸的插入。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是酵母细胞、植物细胞或者动物细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述向...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：