一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法。本发明专利技术首先采用物理研磨配合化学酶法离散鸡肠道上皮细胞，提高了肠道细胞离散程度，缩短了细胞处理时间，保证了细胞的高活性；最佳密度细胞分离液的使用，保证了肠道上皮淋巴细胞的纯化；磁珠二抗分选法的使用，确保了目标细胞较高的纯净度；并经过细胞培养，发现本发明专利技术分离培养所得的目标细胞纯度高达90％。本发明专利技术解决了分离培养鸡肠道上皮γδT细胞过程中种种弊端，从而为鸡肠道上皮γδT细胞培养及其生物学和免疫学研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法
本专利技术涉及一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，属于生物

技术介绍
γδT细胞是近20年人们新认识的1种T细胞亚群，其在机体出现异常变化时做出的反应比αβT细胞更为迅速。与人和其他哺乳动物外周血中只有很少比例(3％～5％)，γδT细胞不同，家禽外周血中γδT细胞占到约50％左右。在受到病原体入侵时，家禽黏膜上皮和外周血中的γδT细胞在机体初期防御中发挥重要作用。但是长期以来鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养一直较为困难。传统研究多集中于体外扩增淋巴细胞并选择性计数γδT细胞(董思源.γδT细胞体外扩增，i-IELs分离和免疫荧光技术的建立.天津:南开大学，2011)，这种方法并未将γδT细胞与其他淋巴细胞分离开。由于γδT细胞的增殖受到多种淋巴细胞分泌的细胞因子的影响，而且体外扩增过程已将γδT细胞活化，故传统方法并不能完全独立研究其静息态下的生物、免疫活性及其激活机制。利用分离自21～35日龄肉仔鸡肠道上皮γδT细胞进行体外分离培养试验，与之相比，具有明显的优点。该方法分离出的肠道上皮γδT细胞，不受机体肠道其他淋巴细胞的影响，不受肠道食糜中某些活性成分的刺激，并能保持较静息态和一定程度的特异性和免疫性，本方法的建立有利于肉仔鸡肠道中该细胞进一步研究。因此，鸡肠道上皮γδT细胞分离培养方法的建立，为研究鸡肠道上皮γδT细胞生物学和免疫学奠定了基础。鸡肠道上皮细胞的离散是本方法的重要环节。常用方法为剪碎肠道壁后，消化酶消化，但消化酶价格昂贵，然其种类和用量均难确定，处理时间也难以把握。这为肠道上皮淋巴细胞的分离带来了很大的困难。鸡肠道上皮淋巴细胞的分离是本方法的又一重要环节。由于淋巴细胞分离液密度不合适，往往造成分离细胞纯度不高，肠道上皮细胞大量混杂其中。进而大大浪费了下一步操作中抗体和磁珠的用量，增加操作成本。此外，对鸡肠道上皮γδT细胞研究，常用方法为混合淋巴细胞培养，给予目标刺激后，研究其增殖情况及生物免疫活性。但γδT细胞增殖活化与其他淋巴细胞分泌的细胞因子及其接触的肠道上皮细胞都有密切关系。混合培养，并不能清晰反映目标刺激对γδT细胞的直接作用，为γδT细胞研究带来较大问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，降低细胞分离过程中的污染风险和成本，减少因分离时间过长带来的诸多弊端，同时，能够提高目标细胞的纯度。本专利技术解决的上述技术问题所采用的技术方案为：1.一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；步骤2：制备肠壁组织浆液经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×107/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。2.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述步骤1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为1％(V/V)。3.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤1所述的肠段为空肠中段。4.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是步骤2中所述的混合消化酶为胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂其质量比为为2:1。5.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤3中无血清RPMI-1640培养液为RPMI-1640细胞培养基中加入(V/V)0.5％双抗、1％L-谷氨酰胺和1％羟乙基哌嗪乙磺酸，pH7.2～7.4。6.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤4不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1.101g/mL的淋巴细胞分离液原液与PBS一定比例配制而得。7.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤5中的磁珠二抗分选法，具体为先加入一定量TCR1抗体，保证其浓度可达每107个细胞悬液中含有20μL抗体；孵化后，离心去上清；再加入磁珠，使其浓度达到每107个细胞悬液中含有5μL磁珠，孵化离心去上清；PBS重悬细胞，进行细胞分选仪分选。8.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述的步骤1中的禁食时间，24～36h为最佳禁食时间。本专利技术的详细描述：鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法包括以下步骤：步骤1：对21～35日龄肉仔鸡禁食24～36h，静脉放血处死，75％酒精浸泡10～15min；0.1％新洁尔灭浸泡5～10min。取出肉仔鸡绑定，75％酒精消毒仔鸡腹腿部，破开腹腔；双抗溶液喷于腹部各器官表面，手术镊找到空肠中段，取2～3cm肠段于1％双抗PBS溶液中(V/V)。步骤2：将溶液移入超净台，纵向剪开肠壁，1％双抗PBS溶液中冲洗，移入无双抗PBS溶液冲洗，手术剪剥离肠壁脂肪和结缔组织，移入无双抗PBS溶液，手术剪将肠壁剪为浆糊状，玻璃研磨器小心研磨；将组织匀浆液移入离心管，离心；去除上清，加入胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ混合酶制剂(GIBCO公司)(质量比为2:1)，37℃，5％CO2，摇床震荡15min。步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640细胞培养液(其中按体积比加入了0.5％双抗、1％L-谷氨酰胺和1％羟乙基哌嗪乙磺酸，pH调至7.2～7.4)终止消化，离心；去上清，无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过100目，200目自制细胞筛(自制细胞筛为经100目和200目绸布紧固于烧杯而成)，离心去上清。步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；在离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL的淋巴细胞分离液(不同密度淋巴细胞分离液，经过密度为1.101g/mL淋巴细胞分离液原液(TBDScience公司)与PBS一定比例配制而得)；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层，无血清RPMI-1640培养液重悬细胞，离心去上清，洗涤，即为肠道上皮淋巴细胞；显微镜下计数细胞，约为1×107/mL，细胞活率95％以上。步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中加入鼠抗鸡TCR1抗体(SoutherBiotech公司)，轻轻混匀，孵化10min，离心去上清；PBS重悬细胞，使细胞浓度达到1×105/μL，加入磁珠，孵化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；步骤2：制备肠壁组织浆液经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；步骤3：向细胞液加入无血清RPMI‑1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI‑1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×107/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。

【技术特征摘要】
1.一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1：由经过禁食采用静脉放血处死的试验鸡，无菌手术取2～3cm肠段置于含1％双抗的PBS中；步骤2：制备肠壁组织浆液，经离心去上清液后，于沉淀中加入0.05％胶原酶混合酶进行消化；步骤3：向细胞液加入无血清RPMI-1640培养液终止消化，离心；去上清，无血清培养液重悬细胞，离心洗涤细胞；再次重悬细胞，分别经过不同目数自制细胞筛过滤细胞，离心去上清；步骤4：将细胞重悬于密度为1.058g/mL淋巴细胞分离液中；于离心管底部加入4mL密度为1.098g/mL淋巴细胞分离液；将细胞悬液铺于之上，离心；取两个不同密度的淋巴细胞分离液界面黄白色细胞层；步骤5：在浓度为1×107/mL细胞悬液中，先后加入一定量的TCR1抗体和磁珠，进行磁珠二抗分选，并用PBS适当重悬稀释，保证二者与目标细胞结合；将细胞悬液置于细胞分选仪进样口，得到阳性细胞；步骤6：将细胞悬浮于10％胎牛血清RPMI-1640培养液，台盼蓝染色，计数活细胞数，调整细胞浓度为1×107/mL，于二氧化碳培养箱培养48h后，测定其细胞存活情况。2.如权利要求1所述一种鸡肠道上皮γδT细胞的分离培养方法，其特征是所述步骤1中的双抗为青霉素和链霉素，浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海军，杨金玉，武书庚，齐广海，岳洪源，王晶，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11