用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法技术

本发明专利技术提供了纯化视网膜色素上皮细胞的方法，使用该方法可以在短时间内通过简单和容易的操作，从通过诱导多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞获得的细胞群体中，获得高纯度的视网膜色素上皮细胞。该纯化方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从细胞群体纯化视网膜色素上皮细胞的方法，使用上述方法的视网膜色素上皮细胞的生产方法，等，所述细胞群体通过诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞获得。
技术介绍
作为用于从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，已知下列方法：包括在无血清培养基中培养作为悬浮聚集物的ES细胞（专利文献1等）的称为SFEB法的方法，包括在包被有弱细胞粘附包被剂等的培养基质上在分化诱导因子的存在下诱导多能干细胞的分化的方法（非专利文献1等）。然而，由于低分化诱导效率，这些方法需要组合粘附培养和悬浮培养的多个步骤以获得高度浓缩的视网膜色素上皮细胞的细胞群体，并具有下列问题，诸如需要存在具有高工作量和长时间的纯化步骤，其中包括在光学显微镜下选择性地挑取色素细胞的集落。这些方法仅可以在培养容器中获得一部分诱导的RPE细胞，并且所获得细胞的纯度在很大程度上受实验者的技术影响，这成问题地使得这些方法不适合大规模生产。因此，已经要求能够即使当大规模生产RPE细胞时也能够通过简单和容易的方法稳定地得到高纯度的视网膜色素上皮细胞的方法。对于人多能干细胞的维持培养，使用细胞外基质代替饲养细胞的方法已被广泛使用。其中，优选使用层粘连蛋白，并且，例如，非专利文献2报告了人ES细胞在层粘连蛋白-511上的长期成功的维持培养。至于称为具有改进的细胞粘附活性的改变的层粘连蛋白的E8片段，例如，专利文献2和非专利文献3公开了人多能干细胞的培养方法，其使用人层粘连蛋白-α5β1γ1的E8片段（层粘连蛋白-511E8，，下文以相同的方式指示）和人层粘连蛋白-322E8。非专利文献4中记载了层粘连蛋白-511E8保持对α6β1整联蛋白的结合活性，其与全长层粘连蛋白-511是同样水平，并且专利文献2描述了，通过使用所述层粘连蛋白-511E8，多能干细胞可以稳定地固定化在培养皿上，其结果是细胞可以进行维持培养，同时保持分化多能性。然而，除了用于多能干细胞培养例如，多能干细胞的分化诱导等之外，没有报告记载利用这样的层粘连蛋白的E8片段。另一方面，作为不存在饲养细胞的情况下诱导人多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，已知使用层粘连蛋白的方法。例如，非专利文献5描述了通过使多能干细胞在层粘连蛋白-111和基质胶上粘附培养，分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率显著增加。然而，没有报告记载利用层粘连蛋白的E8片段用于将多能干细胞诱导分化成视网膜色素上皮细胞。[文献列表]专利文献专利文献 1: WO 2005/123902专利文献 2: WO 2011/043405[非专利文献]非专利文献 1: PLoS One. 2012; 7(5): e37342.非专利文献 2: Nature Biotech. June 2010; 28(6): 611-5非专利文献 3: Nat. Commun. 3:1236 doi: 10.1038/ncomms2231非专利文献 4: J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009非专利文献 5: J. Tissue Eng Regen Med 2013; 7: 642-653。专利技术概述本专利技术要解决的技术问题本专利技术的一个目的是提供在短时间内通过简单和容易的操作，从通过诱导多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞获得的细胞群体中，纯化高纯度的视网膜色素上皮细胞的方法。解决技术问题的方法本专利技术人已进行了深入研究以尝试实现上述目的，并且发现，当人多能干细胞在包被有层粘连蛋白-E8的培养基质上培养时，接种的多能干细胞迅速粘附到培养基质，从早期阶段产生了大量的色素细胞，视网膜色素上皮细胞的产率可显著提高，而且不仅视网膜色素上皮细胞，还有其它视觉细胞谱系细胞与基质组分一起产生。本专利技术人已进一步发现，单独视网膜色素上皮细胞可以有效地从在层粘连蛋白上产生的视网膜色素上皮细胞纯化，即使它们埋藏在其它细胞和基质组分中，通过在过滤器上引入所有这些的简单操作。他们已进一步发现，低回收率，其是在诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞中的问题，可以显著提高，并且可以方便和稳定地纯化所需视网膜色素上皮细胞。本专利技术人此后已进行了深入的研究，并完成了本专利技术。也就是说，本专利技术涉及以下内容。[1]纯化视网膜色素上皮细胞的方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。[2]上述[1]的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-E8片段。[3]上述[1]或[2]的方法，其中含有所述视网膜色素上皮细胞的细胞群体通过在分化诱导后用细胞分离溶液处理进行回收。[4]上述[3]的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。[5]上述[1]-[4]任一项的方法，其中所述过滤器具有20–70 μm的孔径。[6]从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，其包括（1）通过诱导在层粘连蛋白或其片段上的多能干细胞的分化，获得含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体的步骤；和（2）在过滤器上引入（1）中获得的细胞群体，以获得经过所述过滤器的细胞群体的步骤。[7]上述[6]的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-E8片段。[8]上述[6]或[7]的方法，其中在步骤（1）中获得的细胞群体通过用细胞分离溶液处理含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体进行回收。[9]上述[8]的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。[10]上述[6]-[9]任一项的方法，其中所述过滤器具有20–70 μm的孔径。[11]通过上述[6]-[10]任一项的方法获得的视网膜色素上皮细胞。[12]通过上述[6]-[10]任一项的方法获得的视网膜色素上皮细胞片。专利技术效果根据本专利技术，从多能干细胞诱导的视网膜色素上皮细胞，可以方便地以高产率纯化。附图简述图1是显示层粘连蛋白-E8的结构的示意图。图2显示从人iPS细胞（201B7和1120C7）诱导的RPE细胞的RPE相关基因的表达。图3显示立即纯化前培养的细胞的状态。图4显示用过滤器纯化之前和之后视网膜色素上皮细胞标志物基因，祖细胞和神经细胞标志物基因的表达。该值显示相对值±标准偏差（n= 1,3重复测量），过滤前表达水平为1。具体实施方案1.纯化方法和视网膜色素上皮细胞的生产方法本专利技术涉及纯化视网膜色素上皮细胞的方法（下文也称为本专利技术的纯化方法），包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。本专利技术还涉及从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法（下文也称为本专利技术的生产方法），其特征在于使用所述方法。本专利技术的生产方法包含下列两个主要分开的步骤：（1）通过诱导在层粘连蛋白或其片段上的多能干细胞的分化，获得“含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体”的步骤；和（2）将（1）中获得的“含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体”引入到过滤器以纯化视网膜色素上皮细胞的步骤。本专利技术的纯化方法针对所述步骤（2）。每个步骤在下文详细解释。（1）获得含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体的步骤在步骤（1）中，多能干细胞通过用包被有层粘连蛋白或其片段的培养基质的粘附培养进行分化诱导，并得到含有视网膜色素上本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化视网膜色素上皮细胞的方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.09 JP 2013-2123451.纯化视网膜色素上皮细胞的方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。2.根据权利要求1的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-E8片段。3.根据权利要求1或2的方法，其中含有所述视网膜色素上皮细胞的细胞群体通过在分化诱导后用细胞分离溶液处理进行回收。4.根据权利要求3的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述过滤器具有20–70 μm的孔径。6.从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：泽田昌典，关口清俊，
申请(专利权)人：希里欧斯株式会社，国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP