获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；以及，(ii)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。有利地，可进行额外的步骤，以获得RPE细胞和/或神经视网膜前体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞 的方法
技术介绍
感光细胞或支持视网膜色素上皮细胞(RPE)的功能受损或功能完全丧失，是导致 视网膜疾病(诸如遗传性视网膜变性和年龄相关性黄斑变性(AMD))中的不可逆失明的主要 原因。青光眼中的视网膜神经节细胞(RGC)死亡也导致视力的不可逆丧失。挽救退变性视网 膜是主要挑战，而且细胞替换是最有希望的方式之一(Pearson et al.，2012;Barber et al.，2013)。使用人类多能干细胞、胚胎干(ES)细胞和诱导多能干（iPS)细胞开启了用于人 类视网膜变性疾病的新途径。人类ES(hES)和iPS(hiPS)细胞可用作进行组织移植的视网膜 细胞(光感受器、RPE和RGC)的无限制来源，其中人类ES(hES)和iPS(hiPS)细胞具有在培养 时无限扩增，同时保持它们的多能状态的能力（参见综述:(3〇1117116丨31.，2010 ;〇31111]^1111-Noor et al ·，2010，Boucherie et al ·，2011)。但是，这一新技术仍然面临很多困难。尤其 是，目前分化程序还不够完善，不足以确保效率和安全性。几篇公开文件指出，hES和hiPS细 胞可通过细胞培养物中的集落进行自发分化(Buchholz et al.，2009;Vaajasaari et al· ,2011 ;Zahabi et al .,2012)，或通过不同的漂浮聚集方法（Idelson et al.，2009;Lu et al.，2009;Kokkinaki et al.，2011)，相对容易地分化成RPE细胞。越来越多的汇聚数据 证明，hES或hiPS具有在拟胚体形成之后转化成神经视网膜谱系，并且进一步分化成表达光 感受器标记物的细胞的能力（Lamba et al .,2006,2009 ;0sakada et al .,2008,2009 ; Meyer et al.，2009，Mellough et al.，2012)。之前开发的不同方法尽管有真正的进步，但 是仍然存在通常与多能干细胞分化成高特化的细胞类型相关的缺点。用于hES或hiPS细胞 向光感受器定向分化的这些方案需要几个步骤，添加几种分子，而且效率相当低。目前，其 它组试图进一步从hES或hiPS细胞的拟胚体获得视泡样结构的3D结构（Meyer et al.， 2011 ;Nakano et al. ,2012)。分化方法使用基质胶(matrigel)，来再创建围绕拟胚体的复 杂的细胞外基质(ECM)，从而允许神经上皮的自形成，并且或快或慢地分化成感光细胞谱系 (Meyer et al.,2011；Nakano et al.,2012；Boucherie et al.,2013；Zhu et al.,2013)〇 因此，现有技术中需要一种在体外准确模拟分化和发育的简单、有效且可靠的方 法，来获得特定的人类神经上皮谱系细胞的基本纯的培养物，其中特定的人类神经上皮谱 系细胞包括视网膜祖细胞、RPE细胞和神经视网膜细胞。
技术实现思路
如在下面的实验部分所公开的，专利技术人现在使iPS细胞进行一种组合了2D和30培 养系统的新的视网膜分化方案。该方案避免形成拟胚体或细胞团，并且可在没有基质胶或 血清时进行。专利技术人证明，培养在促神经培养基中的融汇的hiPS细胞可在两周内生成具有 眼域(eye field)特征的神经上皮样结构，当转换成3D培养时，该神经上皮样结构可分化成 主要的视网膜细胞类型。在这些条件下，hiPS细胞自组装成神经视网膜样组织，并且在发育 的适当时间窗中具有视网膜标记物的快速表达;它们产生不同的视网膜细胞类型，诸如RGC 和光感受器。 因此，本专利技术的第一目标是一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，该方 法包括以下步骤： (i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；并且 (ii)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上 皮样结构。 在本文中，"视网膜祖细胞（progenitor )"，也被称为"视网膜先祖细胞 (progenitor cell)"，涵盖有能力生成神经视网膜的全部细胞类型的细胞，包括光感受器 的前体以及能分化成RPE的细胞。 "人类多能干细胞"包括人类胚胎干(hES)细胞和人类诱导多能干(hiPS)细胞。上 述方法有利地使用人类诱导多能干细胞进行。 "促神经培养基"在本文中指有利于神经元细胞的维持和/或生长的任意培养基。 这样的培养基的非限制性实例是由营养培养基构成的任意培养基，诸如杜氏改良伊格尔培 养基（Dulbeco's Modified Eagle Medium):营养混合物F_12(DMEM/F12)或Neurobasal?.培 养基(Gibco?)，上述营养培养基补充有培养基补充物，该培养基补充物包括以下成分的至 少一部分:碳源、维生素、无机盐、氨基酸和蛋白消化物。适于获得促神经培养基的补充物的 非限制性实例是N2、B27、G5和BIT9500补充物，以及衍生自这些补充物的任意补充物。存在 于这些补充物中的组分总结于下面的表1中。 表1:促神经培养基的四种培养基补充物的组成，参见Brewer et al.，1993;b由制 造商提供(Gibco BRL，德国）；c由制造商提供(StemCell Technologies Inc.，加拿大）一由 制造商提供(Life Technologies，USA) 〇 在下文中，"神经上皮样结构"，在下面的实验部分中也被命名为"神经视网膜样结 构"，指在促神经培养基中培养几天之后开始出现的相光(phase-bright)结构。这些结构基 本上由不显著表达多能相关基因（诸如0CT4)，但表达与眼区特化（eye-field specification)相关的转录因子(诸如LHX2、RAX、PAX6和SIX3)的细胞构成。如在实验部分 中所公开的，当进行上述方法时，首先出现色素细胞，而神经上皮样结构最常出现在色素细 胞斑块的附近。 当然，在进行根据本专利技术的方法时，技术人员可检测多种标记物的表达（以检验它 们的表达或检验它们不再被表达的事实，和/或定量测量它们的表达水平）。为了实现这一 目的，可使用本领域已知的任意技术，例如定量RT-PCR和免疫测定。多能性标记物的实例是 0CT4、S0X2和NAN0G;眼区标记物的实例是1^乂、?六乂6、(1^2、1^^2和3^3，前两个是优选的。 有利地，可在不使用复杂且昂贵的培养基的情况下进行上述方法。实际上，可使用 非常简单的培养基，从多能干细胞的贴壁培养物中获得人视网膜祖细胞。尤其不需要分化 因子。根据上述方法的优选实施方式，在培养步骤中使用的促神经培养基缺乏以下分化因 子中的至少一种：头蛋白（noggin)、Dkk-l和IGF-1。尤其是，促神经培养基可缺乏这三种因 子。 在步骤（i)中使用的人类多能干细胞可在任意类型的贴壁培养系统中培养。可用 于这种培养的表面的非限制性实例是:玻璃、塑料(可能是经过处理的）、胶原、层粘连蛋白、 纤连蛋白、Matrigel?、聚-L-赖氨酸、滋养细胞，或市场上可购买本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，包括以下步骤：(i)将人类多能干细胞的贴壁培养物放置于促神经培养基中；以及(ii)使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：萨夏·赖奇曼，奥利维尔·古瑞奥，约瑟阿兰·萨赫尔，
申请(专利权)人：皮埃尔玛丽居里大学巴黎第六大学，国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国;FR