一种诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法。它是将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接入诱导分化培养基中进行培养，种子细胞分化成视网膜神经节细胞，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基。本发明专利技术从干细胞诱导分化的角度提供了获得一种功能性RGCs新的研究途径，为人iPSc-RGCs的定向分化提供了一种新的研究思路，为探讨人iPSc-RGCs的调控机制提供了新的研究线索，为神经组织工程的研究提供了一种新的种子细胞，并为干细胞移植治疗视觉损伤奠定了理论和实验基础。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术属于发育生物学和生物医学工程领域，具体涉及。
技术介绍
:视网膜神经元的损伤和修复是神经性视觉损伤发生、发展和转归共同的科学问题。近年随着干细胞研究的迅速发展，诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcells, iPSCs)为视觉神经损伤的修复与治疗带来了新的希望。由于iPSCs自我复制和多分化潜能，作为修复神经系统损伤的供体不但能满足移植时所需的细胞量，而且iPSCs在一定条件下能诱导分化为包括神经元在内的不同的神经细胞系。因此，将人源性的iPSCs通过移植治疗视觉神经损伤并恢复机体功能，具有重要的理论意义和良好的临床治疗前景。研究发现将iPS细胞直接移植到受损的视网膜组织后，90%以上的细胞均分化为星形胶质细胞，几乎没有神经元的存在。而神经元对损伤后视功能的恢复起着决定性的作用。因此，能否在体外将iPS细胞定向诱导分化为特定的视网膜神经元就成为制约其临床应用的关键问题之一。众多的研究表明，睫状神经营养因子(CNTF)可特异性地促进iPS分化成为星形胶质细胞；脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)、胶质源性神经营养因子(NF)、视黄酸等均可促进iPS向神经元方向分化。NT4、BDNF可保护中枢神经元免受兴奋性神经递质的损害，神经营养因子通过稳定细胞膜内钙离子的水平而保护神经元免受兴奋性神经递质的损害，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)可诱导BDNF的表达。BDNF、NGF、⑶NF对体外压力作用下的视网膜神经细胞具有保护作用。总之，目前化学因素对iPS定向分化诱导的神经元主要为运动神经元和多巴胺能神经元。而将人iPSCs源性3D视网膜利用化学因子将其特异分化为RGCs的研究还未见明确的报道。由于RGC是视网膜重要组成部分，将人iPSCs源性3D视网膜定向分化为功能性RGCs无论对干细胞与再生医学的基础研究还是眼科学临床治疗都具有重要的理论和实际应用价值。发育生物学研究表明，无论是低等还是高等的动物，其视觉系统的发育和可塑性变化均需要精确的时间和空间的调控，从视泡、视杯发育到神经视网膜、视网膜色素上皮的分化进一步发育分化成为精细的视网膜结构。因此认为RGCs的发育与成熟除了化学因素影响外，精细的时空调控也是必不可少的重要诱导条件。由于RGCs在视觉信号的传入、视觉信息的传导完整以及视功能维持等方面均具有重要的作用，其损伤后较难以通过其它方式进行替代。因此，视觉神经损伤后恢复RGCs的数目和功能不仅有助于减缓视神经损伤病人病情的恶化，促进患者视觉功能的恢复，也必将促进损伤视神经结构和功能的重建，对整个神经系统的损伤修复以及神经组织工程学的研究也会产生积极的推动作用。
技术实现思路
:为了克服现有种子细胞来源诱导功能低下的问题，本专利技术提供一种体外诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞(RGCs)的方法。本专利技术的诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法，包括以下步骤:将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接入诱导分化培养基中进行培养，种子细胞分化成视网膜神经节细胞，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子(bFGF、CNTF, BDNF)和维持浓度的视网膜分化营养液(RDM)组成的培养基。所述的诱导分化培养基优选为:每ml含有bFGF 10ng、BDNF 20ng、CNTF 20ng、N2 supplement lng、非必须氨基酉爱(essential media-non essential amino acidsNEAAs) lng、肝素2 μ g，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1:1混合而成。bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，BDNF为脑源性神经营养因子，CNTF为亲胆喊能神经元因子，N2supplement 为 N2 添加剂，essential media-non essential aminoacids (NEAAs)为非必须氨基酸，heparin为肝素，它们都是现有技术中的物质。所述的将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞优选为将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。所述的培养优选是在37°C、5% C02，饱和湿度下进行培养。本专利技术人团队前期已成功将人源性的iPSc细胞诱导分化为人iPSc源性的3D视网膜(Xiufeng Zhong, et al.Generat1n of three-dimens1nal retinal tissue withfunct1nal photoreceptors from human iPSCs, Nat Commun.2014Jun 10 ;5:4047)。本专利技术中首先将该人iPSc源性的3D视网膜组织神经纤维层机械分离消化为单细胞，以其作为种子细胞接种于含特定神经营养因子(bFGF、CNTF, BDNF)的无血清培养环境中，通过时间调控和化学因子共同作用，将种子细胞定向诱导分化为功能性的视网膜神经节细胞(RGCs)。本专利技术不仅对视神经损伤的救治与功能康复有重要的理论和实际意义，而且对整个神经系统组织工程中种子细胞的研究也有积极的推动作用。本专利技术从干细胞诱导分化的角度提供了获得一种功能性RGCs新的研究途径，为人iPSc-RGCs的定向分化提供了一种新的研究思路，为探讨人iPSc-RGCs的调控机制提供了新的研究线索，为神经组织工程的研究提供了一种新的种子细胞，并为干细胞移植治疗视觉损伤奠定了理论和实验基础。【附图说明】:图1是不同时间诱导分化下RGC细胞轴突的生长情况，分化的RGCs轴突随时间变化而增长，其培养7天轴突长度为169.02-322.05 μπι(Α)，14天后轴突长度为170.35-369.21 μπι(Β)，21 天轴突长度为 269.28-508.87 ym(C)；图2是RGC细胞生长14天后的细胞抗体Brn3b (A)，Tubulin (B)及Nestin(C)免疫荧光染色；图3是视网膜神经节细胞(RGC)细胞生长21天后细胞轴突蛋白(NFH)免疫荧光染色；图4是RGC细胞生长21天后细胞钠离子通道蛋白(Nav1.6)免疫荧光染色图5是应用膜片钳技术检测RGC细胞的动作电位结果，其中A为RGC细胞动作电位，B为使用河豚毒素干扰RGC细胞后动作电位下降，洗脱毒素后动作电位恢复。【具体实施方式】:以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导人iPSc源性的3D视网膜定向分化为视网膜神经节细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将人iPSc源性的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接入诱导分化培养基中进行培养，种子细胞分化成视网膜神经节细胞，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛坚，钟秀风，李康寯，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东;44