产生视网膜色素上皮细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种产生视网膜色素上皮细胞的方法。

Method for producing retinal pigment epithelial cells

The invention relates to a method for producing retinal pigment epithelial cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利
】本专利技术涉及一种由多能性细胞产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法。本专利技术也涉及通过此方法获得或可获得的细胞及其用于治疗视网膜疾病的用途。本专利技术也涉及一种用于延展RPE细胞的方法。【专利技术背景】视网膜色素上皮是在感觉神经性视网膜外，底层的脉络膜(视网膜后的血管层)与上层的视网膜视细胞(如光感受器的视杆细胞及视锥细胞)之间的色素沉着细胞层。视网膜色素上皮对光感受器及视网膜的功能与健全非常重要。视网膜色素上皮通过回收光色素，传输、代谢、以及贮存维生素A，吞噬视杆细胞的外节，在视网膜与脉络膜之间传输铁及小分子，维持玻璃膜(Bruch’smembrane)与吸收漫射光使影像分辨率较好而维持光感受器的功能。视网膜色素上皮的退化可造成很多与视觉改变有关的疾病视网膜脱落、视网膜发育不全、或视网膜萎缩，导致光感受器的损坏与失明，如脉络膜缺失、糖尿病视网膜病变、黄斑变性(包括与年龄相关的黄斑变性)、色素性视网膜炎、以及Stargardt氏症(Stargardt'sDisease)。对这些疾病的有效的治疗是将RPE细胞移植至患有该疾病的视网膜。据信，通过移植来补给视网膜色素上皮细胞可能延迟、中止或逆转变性，改善视网膜功能并预防由这些条件导致的失明。动物模型中已证明通过RPE细胞的次视网膜移植可实现光感受器救助与视觉功能保留(见例如Coffey,PJetal.Nat.Neurosci.2002:5,53-56；Sauve，Yetal.Neuroscience2002:114，389-401)。因此，有很大的兴趣寻找产生RPE细胞的方法，例如以多能性细胞作为用于治疗视网膜疾病的细胞移植的来源。已证明小鼠与非人类的灵长目的胚胎干细胞分化成RPE细胞，以及在移植后存活并弱化视网膜病变的潜力。已显示人类胚胎干细胞自发性分化成RPE细胞(参见实施例WO2005/070011)。然而，这些方法的效率与再现性是低的。因此，需要能良好地被控制、可再现、有效率和/或适合大规模生产的产生RPE细胞的方法以及用于药物筛选、疾病模拟和/或治疗用途的产生RPE细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种产生RPE细胞的方法。证明此方法提供强健且可再现的多能性细胞如人类胚胎干细胞(hESCs)的分化，以生成RPE细胞。另外，本文提供的方法是容易量化生产而产生高产量的RPE细胞。本文公开的方法可例如而非限制地在不含异物的条件下用于可再现地及高效率地分化多能性细胞如hESC分化成RPE细胞。本文提供产生RPE细胞的方法。在某些实施方式中，本方法包含步骤：(a)在第一SMAD抑制剂与第二SMAD抑制剂的存在下培养多能性细胞；(b)在骨形态生成蛋白质(BMP)通路活化剂的存在下且无第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的细胞；及(c)再铺板步骤(b)的细胞。在该方法的某些实施方式中，该方法进一步包含下列步骤：(d)在活化素通路活化剂的存在下培养步骤(c)的经再铺板的细胞；(e)再铺板步骤(d)的细胞；及(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞。在该方法的另一个实施方式中，步骤(b)进一步包含，在BMP通路活化剂的存在下培养细胞之后，在无BMP通路活化剂的存在下培养细胞至少10天；步骤(c)包含再铺板步骤(b)的具有卵石状形态的细胞；且该方法进一步包含步骤：(d)培养步骤(c)的再铺板的细胞。还提供延展RPE细胞的方法。在某些实施方式中，方法包含下列步骤：(a)以密度介于1000至100000细胞/cm2接种RPE细胞，以及，(b)在SMAD抑制剂、cAMP或增加胞内cAMP浓度的试剂的存在下培养该RPE细胞。还提供纯化RPE细胞的方法，包含：a)提供包含RPE细胞与非RPE细胞的细胞群；b)通过就表达CD59的细胞而言富集该细胞群以增加细胞群中RPE细胞的百分比。通过本文所公开的方法还提供或可获得的RPE细胞。还提供药物组合物。药物组合物包含适合移植入患有视网膜疾病的受试者的眼睛的RPE细胞。在某些实施方式中，药物组合物包含一个适于支撑RPE细胞的结构。在某些实施方式中，药物组合物包含多孔的膜及RPE细胞。在某些实施方式中，膜的孔的直径介于约0.2μm至约0.5μm且孔的密度介于每cm2约1x107至约3x108个孔。在某些实施方式中，膜是被涂覆在有涂覆层的支撑RPE细胞的一侧上。在某些实施方式中，涂覆层包含醣蛋白，优选为选自层粘连蛋白或人类玻连蛋白(vitronectin)。在某些实施方式中，涂覆层包含人类玻连蛋白。在某些实施方式中，膜是由聚酯制成。还提供受试者的视网膜疾病的治疗方法。在某些实施方式中，方法包含将本专利技术的RPE细胞利用于受视网膜疾病影响或有视网膜疾病风险的受试者，由此治疗视网膜疾病。【图示简单说明】图1A显示前期及后期的再铺板方法的特定实施例的示意图。图1B与1C显示在用SMAD抑制剂处理期间的不同时间点通过免疫细胞化学法测量的指示表达PAX6与OCT4的细胞的百分比的图。图1B：用LDN/SB诱导的样品。图1C：没有用LDN/SB诱导的样品。图1D显示在用SMAD抑制剂处理2天(LDN/SB2D)后或5天(对照组+)后通过免疫细胞化学法测量的指示表达PAX6(上图)与OCT4(下图)的细胞的百分比的图。图2A显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Mitf(上图)及Silv(PMEL17)(下图)的相对表达的图。图2B显示通过免疫细胞化学法测量的指示表达MITF(上图)及PMEL17(下图)的细胞的百分比的图。图2A与2B显示在步骤(a)之后用BMP通路活化剂处理对于诱导MITF与PMEL17的表达是必要的。图3显示用不同BMP通路活化剂处理之后通过免疫细胞化学法(上图)或qPCR(下图)测量的指示表达MITF的细胞的百分比的图。图3显示可用于本文公开的方法的步骤(b)的不同BMP通路活化剂。图4A显示在不同条件下通过免疫细胞化学法测量的指示表达CRALBP的细胞的百分比的图。图4B显示在不同条件下通过免疫细胞化学法测量的指示表达MERTK的细胞的百分比的图。图4C显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Rlbp1(CRALBP)(上图)与Mitf(下图)的相对表达的图。图4D显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Mertk(上图)与Best1(下图)的相对表达的图。图4E显示在不同条件下通过qPCR测量的指示Silv(PMEL17)(上图)与Tyr(下图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，其包含步骤：(a)在第一SMAD抑制剂与第二SMAD抑制剂的存在下培养多能性细胞；(b)在BMP通路活化剂的存在下且无该第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的细胞；及(c)再铺板步骤(b)的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.11 US 61/914,4451.一种产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，其包含步骤：
(a)在第一SMAD抑制剂与第二SMAD抑制剂的存在下培养多能性细胞；
(b)在BMP通路活化剂的存在下且无该第一与第二SMAD抑制剂的情况下培养步骤(a)的
细胞；及
(c)再铺板步骤(b)的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，单层培养细胞。
3.根据权利要求1或2的方法，其中，在步骤(b)中，单层培养细胞。
4.根据权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，细胞在悬浮培养中培养。
5.根据权利要求1,2或4中任一项的方法，在步骤(b)中,其中细胞在悬浮培养中培养。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中该多能性细胞是胚胎干细胞或诱导性多能
性干细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中该多能性细胞是人类细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中该多能性细胞是人类胚胎干细胞。
9.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中该多能性细胞是人类诱导性多能性干细
胞。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中该多能性细胞是通过不需破坏人类胚胎
的手段获得。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂为BMP1型受体ALK2的
抑制剂。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂为BMP1型受体ALK2和
ALK3的抑制剂。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂防止Smadl、Smad5和/
或Smad8磷酸化。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂为dorsomorphin衍生
物。
15.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂选自dorsomorphin、
头蛋白(noggin)或原肠胚双向形成相关蛋白(chordin)。
16.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中该第一SMAD抑制剂选自4-(6-(4-(哌嗪-
1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉(LDN193189)或其盐或水合物。
17.根据权利要求第1至16中任一项的方法，其中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓
度介于0.5nM至10μM。
18.根据权利要求第1至17中任一项的方法，其中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓
度介于500nM至2μM。
19.根据权利要求第1至18中任一项的方法，其中，在步骤(a)中，第一SMAD抑制剂的浓
度为约1μM。
20.根据权利要求第1至19中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂为ALK5抑制剂。
21.根据权利要求第1至20中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂为ALK5和ALK4的抑
制剂。
22.根据权利要求第1至21中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂为ALK5和ALK4和
ALK7抑制剂。
23.根据权利要求第1至20中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂是选自：
4-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)_1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺；
2-甲基-5-(6-(间甲苯基)-1H-咪唑并[1,2-a]咪唑-5-基)-2H-苯并[d][l,2,3]三唑；
2-(6-甲基吡啶-2-基)-N-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-胺；
2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶；
4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)苯酚；
2-(4-甲基-1-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)噻吩并[3,2-c]吡啶；
4-(5-(3,4-二羟基苯基)-1-(2-羟基苯基)-1H-吡唑-3-基)苯甲酰胺；
2-(5-氯-2-氟苯基)-N-(吡啶-4-基)喋啶-4-胺；
6-甲基-2-苯基噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮；
3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(A83-01)；
2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶(SB-
505124)；
7-(2-吗啉乙氧基)-4-(2-(吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉
(LY2109761)；
4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY364947)；或
4-(4-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺
(SB-431542)；或其盐或水合物。
24.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中该第二SMAD抑制剂是4-(4-(苯并[d][1,
3]二氧杂环戊烯-5-基)-5-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺(SB-431542)。
25.根据权利要求1至24中任一项的方法，其中在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介
于0.5nM至100μM。
26.根据权利要求1至25中任一项的方法，其中在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度介
于1μM至50μM。
27.根据权利要求第1至26中任一项的方法，其中在步骤(a)中，第二SMAD抑制剂的浓度
为约10μM。
28.根据权利要求第1至27中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养至
少1天。
29.根据权利要求第1至28中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养至
少2天。
30.根据权利要求第1至29中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养2
至10天。
31.根据权利要求第1至30中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养3
至5天。
32.根据权利要求第1至31中任一项的方法，其中在步骤(a)中，该多能性细胞被培养约
4天。
33.根据权利要求第1至32中任一项的方法，其中在步骤(a)之前，该细胞在起始密度至
少1000细胞/cm2被单层培养。
34.根据权利要求1至33中任一项的方法，其中在步骤(a)之前，该细胞在起始密度
100000至500000细胞/cm2被单层培养。
35.根据权利要求1至34中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂包含BMP。
36.根据权利要求1至35中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂包含选自BMP2、BMP3、
BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP10、BMP11或BMP15的BMP。
37.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP同二聚体。
38.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP异二聚体。
39.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP2/6异二聚体、
BMP4/7异二聚体或BMP3/8异二聚体。
40.根据权利要求1至36中任一项的方法，其中该BMP通路活化剂为BMP4/7异二聚体。
41.根据权利要求1至40中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该BMP通路活化剂的浓度
介于1ng/mL至10μg/mL。
42.根据权利要求1至41中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该BMP通路活化剂的浓度
介于50ng/mL至500ng/mL。
43.根据权利要求1至42中任一项的方法，其中在步骤(b)中，该BMP通路活化剂的浓度
为约100ng/mL。
44.根据权利要求1至43中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述细胞被培养至少1天。
45.根据权利要求1至44中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述细胞被培养2至20天。
46.根据权利要求1至45中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述细胞被培养约3天。
47.根据权利要求1至46中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度至少1000
细胞/cm2被再铺板。
48.根据权利要求1至47项中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度100000
至1000000细胞/cm2被再铺板。
49.根据权利要求1至48中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞以密度约500000
细胞/cm2被再铺板。
50.根据权利要求1至49中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述细胞被再铺板在
纤连蛋白或上。
51.根据权利要求1至50中任一项的方法，其中该方法进一步包含下列步骤：
(d)在活化素通路活化剂的存在下培养步骤(c)的经再铺板的细胞；
(e)再铺板步骤(d)的细胞；及
(f)培养步骤(e)的经再铺板的细胞。
52.根据权利要求51的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养至少1天。
53.根据权利要求51或52的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养至少3天。
54.根据权利要求51至53中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞被培养3至20天。
55.根据权利要求51至54中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该活化素通路活化剂的
浓度介于1ng/mL至10μg/mL。
56.根据权利要求51至55中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该活化素通路活化剂的
浓度为约100ng/mL。
57.根据权利要求51至56中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该活化素通路活化剂为
活化素A。
58.根据权利要求51至57中任一项的方法，其中在步骤(d)中，该细胞在cAMP的存在下
被培养。
59.根据权利要求58的方法，其中在步骤(d)中，cAMP的浓度为约0.5mM。
60.根据权利要求51至59中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞以密度至少
1000细胞/cm2被再铺板。
61.根据权利要求51至60中任一项的方法，其中在步骤(e)中，该细胞以密度20000至
500000细胞/cm2被再铺板。
62.根据权利要求51至61中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述细胞以密度约
200000细胞/cm2被再铺板。
63.根据权利要求51至62中任一项的方法，其中在步骤(e)中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·乔杜里，B·苏尔马齐科德勒，H·D·E·布思，P·J·惠廷，
申请(专利权)人：辉瑞有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB