一种视网膜变性模型及其药物筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种视网膜变性模型，用慢病毒介导的反义mir‑24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射。与现有技术相比，本发明专利技术首次采用慢病毒介导的反义mir‑24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射，建立视网膜变性模型，选择性破坏RPE细胞，引起继发性视网膜膜变性，具有视网膜变性的病例特征。本发明专利技术提供的这种模型可用于研究视网膜变性的机制和药物筛选。本发明专利技术模型是封闭一个RPE细胞重要的一个miRNA‑‑‑mir‑24，根据miRNA的作用机制(一个miRNA作用多个靶基因)，更能模拟特发性AMD发病的特征。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物模型，尤其是涉及一种视网膜变性模型及其药物筛选方法。
技术介绍
目前视网膜变性的模型分为遗传性和化学性两种，化学性模型的一种典型模型是利用碘酸钠诱导，对于碘酸钠诱导的记性视网膜变性模型由于病程非常急，碘酸钠作为一个强氧化剂，虽然破坏了视网膜色素上皮细胞(RPE)，同时也破坏光感受器细胞，因此虽然有相关碘酸钠诱导猴子视网膜变性模型的报道(比如中国专利CN 102198278 A即公开了一种恒河猴视网膜变性模型及其药物筛选方法)，但是其重复性较差，很难重复出来。对于遗传性模型，有单基因突变导致的遗传性年龄相关性黄斑变性(AMD)大鼠模型(RCS大鼠)，由于Mertk基因突变因其RPE细胞吞噬功能减退，引起继发性视网膜变性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种能够模拟特发性AMD发病特征的视网膜变性模型及其药物筛选方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种视网膜变性模型，用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射。所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒具体是指将反义miR-24序列克隆到慢病毒载体上得到的病毒，所述的miR-24碱基序列如SEQ ID NO.1所示。所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒的注射剂量是3ul，病毒滴度为5-10*10^7tu/ml。所述的模型动物包括大鼠与猴子，优选为SD大鼠或食蟹猴。一种筛选治疗视网膜变性的药物的方法，包括如下步骤：a、用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射，建立视网膜变性模型；b、将候选药物施用于变性模型；c、观察候选药物对视网膜变性、损伤程度的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗视网膜变性的药物。步骤a中，所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒的注射剂量是3ul，病毒滴度为5-10*10^7tu/ml。所述的模型动物包括大鼠与猴子，优选为SD大鼠或食蟹猴。与现有技术相比，本专利技术首次采用用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射，建立视网膜变性模型，选择性破坏RPE细胞，引起继发性视网膜膜变性，具有视网膜变性的病例特征。本专利技术提供的这种模型可用于研究视网膜变性的机制和药物筛选。本专利技术模型是封闭一个RPE细胞重要的一个miRNA-mir-24，根据miRNA的作用机制(一个miRNA作用多个靶基因)，更能模拟特发性AMD发病的特征。附图说明图1为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的视功能降低和视网膜相关基因表达的变化，opsin、rhodopsin和recoverin为光感受器细胞的标记蛋白显著下调；bim、bax、bak等促凋亡基因未见。图2为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的视网膜核层变薄，Muller细胞活化。图3为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的促炎因子CHI3L1表达上调，RPE65表达下调，提示RPE功能减弱。图4为ELISA检测anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的CHI3L1产生增多。图5为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射视网膜引起的RPE细胞破坏，RPE65免疫荧光降低(RBCC铺片)。图6为anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注射引起的渗漏(FFA和眼底照相)。图7为食蟹猴视网膜正常的OCT检测结果；anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注
射7周OCT检测，发现视网膜结构紊乱，RPE曾与外核层粘连。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射，得到视网膜变性模型。反义mir-24为的反义序列如SEQ ID NO.1所示，为CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA。将反义miR-24序列克隆到慢病毒载体上得到慢病毒介导的反义mir-24的病毒是本领域常规的技术手段，也可以购买，即反义mir-24病毒也是商品化的。获得病毒后，分装冻存于-80％。取正常成年SD大鼠，体重200g左右，置于体式显微镜下，并在大鼠眼球上放置凹透镜；用30gauge针头在角巩膜缘后2mm处刺一个针孔，然后用装有33gauge针头的微量注射器从针孔处进针至视网膜下腔，注入3μl(含5-10*10^7tu/ml)病毒。对侧眼视网膜下腔等体积注射等量对照病毒。在注射病毒后的2w、5w和7w进行视网膜电生理(ERG)检测。ERG方法：APS全自动视觉电生理检查仪(APS-2000)购于重庆康华科技有限公司。做视觉电生理功能检查前一天，把DM大鼠转移到暗房，进行暗适应。第二天开始做。大鼠的准备：向大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1mL/500g体重)进行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)让眼球突出，然后给予一滴0.5％托吡卡胺散瞳(Wuxi Shanhe Group，Jiangsu，China)，一滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉(Eisai CoLtd，Tokyo，Japan)，每只眼睛各涂一点导电膏。插电极：地线接大鼠尾巴上，负极接大鼠两耳朵之间，正极接两眼睛角膜上，注意不要触到眼睑和巩膜上。打开软件“视觉电生理图”，点“FERG”，再点1,2通道，一个为左眼通道，另一个为右眼通道，点“设置”，刺激次数为2次，刺激频率为0.05Hz；依次点击刺激强度(1)―0.0006325(cd*s/m)、(5)―0.006325(cd*s/m)、(9)―0.06325(cd*s/m)，每次强度至少间隔2min。点“示波”，待波的基线平稳时，点击“采集”，等听到“嘀”的一声后，采集完毕，点击“保存”。再点击“设置”，修改文档号和刺激强度，依次类推。等所有强度做完后，换下一只大鼠。所有大鼠做完后，打开“文件”，进行标定，双击曲线，曲线变为白色，点击“标定”。标定完a波后，按
空格键，标定b波。所有标定完毕，点击“打印”，保存为.PDF格式。点击左下角按钮，退出软件，关闭电脑，关闭放大器。荧光定量PCR检测：提取RNA采用的是Trizol裂解的方法，主要步骤如下：1.将细胞用PBS缓冲液洗1-2次，按比例加入Trizol裂解液(例如六孔板的一个孔对应1mL裂解液)。2.细胞离壁后，转移到1.5mL的离心管，加入五分之一体积的氯仿，剧烈混匀后，以12000rpm的转速4℃离心15分钟。3.离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入等体积的异丙醇，冰浴20分钟。4.12000rpm的转速4℃离心15分钟，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗1-2次。5.将沉淀室温干燥后，用适量的DEPC水溶解。测浓度。RNA反转录，cDNA第一条链是通过Promega公司的M-MLV反转录酶获得的，主要步骤如下：1.首先取1-2μg的RNA与2μL的oligo d(T)混合，72℃水浴放置5分钟，立即冰浴2分钟后，使oligo d(T)与RNA的poly-A尾巴结合，轻微离心。2.加入1.25μL的dNTP(10μM)、1μL M-MLV反转录酶和0.5μL RNA酶抑制剂，用DEPC水将反应体积调节到25μL。42℃水浴放置1小时。3.70℃放置10分钟使反转录酶失本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种视网膜变性模型，其特征在于，用慢病毒介导的反义mir‑24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射。

【技术特征摘要】
1.一种视网膜变性模型，其特征在于，用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射。2.根据权利要求1所述的一种视网膜变性模型，其特征在于，所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒具体是指将反义miR-24序列克隆到慢病毒载体上得到的病毒，所述的miR-24碱基序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种视网膜变性模型，其特征在于，所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒的注射剂量是3ul，病毒滴度为5-10*10^7tu/ml。4.根据权利要求1所述的一种视网膜变性模型，其特征在于，所述的模型动物包括大鼠与猴子，优选为SD大鼠或食蟹猴。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐国彤，吕立夏，田海滨，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31