一种高效抗炎性PB ODN序列及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体公开了一种高效抗炎性PB ODN序列及其应用，所述序列如SEQ ID NO：1所示，该序列具有高效抗炎作用；含有该序列的制剂非常有利于控制猪疾病和炎症，可成功实现替代或部份替代抗生素，从而降低抗生素及疫苗的使用量；使动物类食品更加安全，符合绿色环保的要求，有利于降低养殖动物生产企业的成本，也能提高养殖企业的养殖效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药
，更具体地，涉及一种高效抗炎性PB ODN序列及其 应用。
技术介绍
国内众多兽用抗炎性药物都主要依靠抗生素，但长期使用抗生素，会导致严重的 耐药性，目前国内外众多企业已经开始限制使用多种抗生素，抗生素的滥用也极大程度限 制了我国肉类食品的出口。另外一个预防兽类疾病的手段就是利用疫苗。但多种病原菌的 血清型众多，疫苗交叉反应，保护效果差。因此急需一种新型安全的抗炎性制剂。 益生菌DNA是益生菌能够抑制多种炎症反应的主要效应因素，其中存在特定的益 生基序（Probiotics Motif)。益生菌DNA中益生基序的筛选与此前从大肠杆菌DNA中筛 选CpG基序具有异曲同工之处。这里，我们为了区别其与哺乳动物来源的抑制性寡核苷酸 (Suppressive oligodeoxynucleotide，Sup 0DN)，将益生菌 DNA 的益生基序命名为益生 ODN (Probiotics oligodeoxynucleotide，PB 0DN)。细菌 DNA 能够通过非甲基化 CpG 序 列作用于宿主免疫系统的TLR9受体，促使B细胞增殖，诱发强烈的Thl炎性反应，增强抗原 抗体反应，因此，细菌DNA早期也被应用于感染治疗。后来，Krieg等筛选出细菌DNA中的 CpG序列（嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶)，进而人工合成含有CpG序列的寡具脱氧核酸（CpG oligodeoxynucleotide, CpG 0DN)，并证实免疫效果远远高于细菌DNA，由此开创了 CpG预 防细菌感染和治疗癌症的光辉历史。 相类似的，2000年，Pisetsky等发现哺乳动物的DNA具有免疫抑制功能。继而发 现了 Sup ODN序列，近来人类微卫星DNA和线粒体DNA等哺乳动物保守区域都成为了新的 Sup ODN的研究位点，从此掀开了抑制性ODN研究的热潮。 2012年，Bouladoux发现Sup基序大量存在于益生菌DNA中，而且认为此前很多有 关益生菌DNA在炎症治疗方面的研究可能最终起作用的就是DNA中存在的Sup基序。认为 在益生菌DNA中存在一类全新的免疫调苄基序，而且具有调控炎症反应，恢复免疫微环境 平衡的功能，申请人对益生菌DNA进行了大量筛选分析工作，发现其中存在类似"ACTTGG" 为特征的高重复率的PB ODN基序，经过验证，确定具有明显的炎症调控能力。因此，从益生 菌DNA中筛选出具有明显炎症抑制活动的特征序列，不仅可以为益生菌的开发利用研究提 供更多信息，也可以控制多种病原体感染后炎症，具有可观的研究前景和价值；但是目前还 没有PB ODN的相关文献及用于防治猪炎症的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种高效安全 的抗炎症PB ODN序列。 本专利技术是第二个目的是提供含有上述PB ODN序列的PB ODN制剂，基于所述制剂， 可成功替代或部份替代抗生素，避免疫苗保护效果不全面的目的。 本专利技术的第三个目的是提供上述PB ODN制剂的应用。 本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种高效抗炎的PB ODN序列，如SEQ ID NO :1所示。本专利技术从益生菌DNA中筛选获得 了一种PB ODN序列，该序列具有高效抗炎作用。 本专利技术所述PB ODN序列获得方法如下：通过对绝大部分大肠杆菌和乳酸杆菌的 保守重复序列进行分析，发现"CCAAGG"和"CCAAGC"可能是两类潜在的抑制性基序，并参 照Bouladoux的方法，从NCBI数据库中获得28种乳酸杆菌的基因组、27种大肠杆菌的基 因组、金黄色葡萄球菌基因组、猪微卫星DNA、猪线粒体DNA和猪端粒酶DNA等近100个基 因组，借助"fuzznuc"在线分析软件分析上述基序的拷贝数，再参照胡大利等(胡大利等， 2007)筛选方法进行ODN活性筛选得到。 在使用前，本专利技术所述PB ODN序列需经过硫代化，硫代化处理为本领域常规技术。 本专利技术还提供含有上述PB ODN序列的制剂(简称为PB ODN制剂);具体的，可以将 经硫代化后的PB ODN序列用无菌PBS溶液配制浓度为10~lOOPg/ml，保存于-15~-25°C。 优选地，所述PBS溶液的组成为：按照重量百分比计，0. 6~I. 0% NaCl、0. 01~ 0· 04% KC1、0. 0124 ~0· 0164% Na2HP04、0. 014 ~0· 034% KH2PO4,在 115 ~121Γ 下，灭菌 15 ~25min〇 具体地，所述灭菌可以采用湿热高压灭菌法，其操作可以参照本领域常规技术。 本专利技术还提供所述PB ODN序列在制备治疗或预防猪疾病的制剂中的应用。 更优选地，所述猪疾病为由猪嗜血杆菌引起的疾病。 本专利技术还提供上述制剂在治疗和/或预防猪疾病中的应用，具体地，当用于治疗 时，是在猪的疾病发病后，立即按每公斤猪重量皮下注射〇. 2~Iml PB ODN制剂，3~7天 后再次给药；当用于预防时，是在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射 0· 1~0· 5ml PB ODN制剂，3~7天后再次给药。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果： 本专利技术提供了一种高效抗炎的PB ODN序列及其应用，该序列具有高效抗炎作用；含有 该序列的制剂非常有利于控制猪疾病和炎症，可成功替代或部份替代抗生素，从而降低抗 生素及疫苗的使用量；使动物类食品更加安全，符合绿色环保的要求，有利于降低养殖动物 生产企业的成本，也能提高养殖企业的养殖效率。【具体实施方式】 下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。 在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的简单修改或替换， 均属于本专利技术的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段。 实施例1 PB ODN的序列（SEQ ID N0:l):5'- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3'，可采用现有基因工程或 化学方法合成，该序列均经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合 成后，用无菌PBS溶液配制成l(^g/ml的制剂（PB ODN制剂)，保存于-15°C备用。 所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，0. 6%的NaCl、0. 01%的KC1、0. 0124%的 Na2HP04、0. 014%的KH2PO4溶于水中；然后米用湿热高压灭菌法在115°C下，灭菌20min。湿 热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。 预防：在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.1 ml所述PB ODN制剂，3天后再次给药。 治疗：在猪的疾病的发病后，立即按每公斤动物重量皮下注射0. 2ml所述PB ODN 制剂，3天后再次给药。 实施例2 PB ODN的序列（SEQ ID N0:l):5'- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3'，可采用现有基因工程或 化学方法合成，该序列均经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合 成后，用无菌PBS溶液配制成3(^g/ml的制剂（PB ODN制剂)，当前第1页1&nbs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效抗炎的PB ODN序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲华，周洁安，蔡海明，马苗鹏，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44