人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法及用于分化的培养基技术

本发明专利技术提供一种人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法，该方法包括：在含有萎蔫酸的培养基中培养人类神经前体细胞。此外，本发明专利技术提供一种用于人类神经前体细胞向多巴胺神经元分化的培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法，更详细地涉及一种包括以下步骤的人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法，所述分化方法包括在含有萎蔫酸(fusaric acid)的培养基中培养人类神经前体细胞。此外,本专利技术涉及用于人类神经前体细胞向多巴胺神经元分化的培养基。
技术介绍
帕金森疾病的特征在于，中脑黑质体(substantia nigra)部位的多巴胺神经元(dopaminergic neurons)选择性地退化。人们正在对通过移植胎儿的中脑组织(fetal midbrain tissue)来取代帕金森疾病患者的多巴胺神经元的治疗方法进行广泛的研究(参见文献I)。移植的胎儿中脑组织在人脑中长期存活，同时对患者的纹状体(striatum)上的多巴胺神经分布进行修复，并减少伴随帕金森疾病的运动症状(motor symptoms)(参见文献2)。虽然上述移植在用于帕金森疾病的治疗方面会有效，但由于难以大量获得人类流产胎儿组织(abortionfetal tissues),因此其临床上的应用被限定在极少数的情况。为了克服这些问题，一直将各种细胞用作治疗帕金森疾病的后补供体细胞进行研究(参见文献3)。—方面，由于来自胎儿中脑组织的人类神经前体细胞(human neural progenitorcells, hNPCs)具有长期的增殖活性，因此其自我增殖能力优异，并且能够向多巴胺神经元进行分化，可期待将其作为用于移植的细胞源来应用(参见文献4及5)。由此，在通过取代多巴胺神经元(即，移植)来治疗帕金森疾病方面，确立可有效增殖(proliferation或expansion)人类神经前体细胞的方法和使人类神经前体细胞有效分化成多巴胺神经元的方法是非常重要的。能够使人类神经前体细胞分化成多巴胺神经元的方法如下。将抗坏血酸和二丁酰环单憐酸腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP)添加到培养基中，分化3天的方法(参见文献6);将BDNF(脑衍生神经营养因子,Brain-derived neurotrophicfactor)、多巴胺、毛喉素(Forskolin)添加到培养基中，分化3周的方法(参见文献7);及使用添加有SHH (音猬因子，Sonic hedgehog)、FGF-8 (成纤维细胞生长因子_8，broblastgrowth facter-8)、BDNF及抗坏血酸的培养基分化3周的方法(参见文献8)等。但是,现有分化方法的分化效率仍然不令人满意，而且需要很长的分化时间，由于需要使用投入有大量SHH或FGF-8等高价添加剂的培养基，因此经济上存在困难，并且在治疗帕金森疾病患者时，缺乏能够使所需大量细胞进行增殖的技术，因此在临床使用方面受到很多限制。
技术实现思路
要解决的技术问题本专利技术提供一种能够以高分化效率使人类神经前体细胞分化成多巴胺神经元的方法及能够有效地应用于上述分化的用于分化的培养基。特别地，本专利技术以萎蔫酸作为新型分化诱导剂，提供一种使hNPCs有效地分化成多巴胺神经元的方法及能够有效地应用于所述分化的用于分化的培养基。由此，本专利技术的目的在于，提供一种在含有新型分化诱导剂的培养基中，使人类神经前体细胞分化成多巴胺神经元的方法。·此外，本专利技术的目的还在于，提供一种对于使人类神经前体细胞分化成多巴胺神经元有用的用于分化的培养基。技术方案 根据本专利技术的一个实施方式，提供一种人类神经前体细胞向多巴胺神经元的分化方法，其包括在含有萎蔫酸的培养基中培养人类神经前体细胞。根据本专利技术的分化方法，所述培养基为在含有二丁酰环单磷酸腺苷、毛喉素、B27、SHH及FGF8的多巴胺神经元分化用培养基中添加萎蔫酸而形成。选择性地，在本专利技术的分化方法中，所述培养基可以是含有萎蔫酸、db-cAMP、毛喉素及B27的NB培养基，优选地，可以是含有50 u M 4mM萎蔫酸、50 u M 4mM db-cAMP、5 20 u M毛喉素及0. 5飞重量％B27的NB培养基。更优选地，所述培养基可以是含有100 ii M萎蔫酸、100 u M db-cAMP、IOuM毛喉素及2重量％B27的NB培养基。在本专利技术的分化方法中，所述培养优选在氧分压为2 10%的低氧分压条件下实施。根据本专利技术的另一实施方式，提供一种用于分化的培养基，其为用于人类神经前体细胞向多巴胺神经元分化的培养基，所述培养基为含有萎蔫酸、db-cAMP、毛喉素及B27的NB培养基。所述用于分化的培养基为含有50 u M 4mM萎蔫酸、50 u M 4mMdb-cAMP、5 20 y M毛喉素及0. 5 5重量％B27的NB培养基，优选地，可以为含有100 u M萎蔫酸、100 u M db-cAMP、IOuM毛喉素及2重量％B27的NB培养基。有益效果本专利技术发现在萎蔫酸存在条件下培养人类神经前体细胞的情况下，能够显著地增加向多巴胺神经元的分化。特别是能够以价格低廉的萎蔫酸作为替代物质，用其代替因价格昂贵而使用受限的高价分化诱导剂SHH及FGF8，从而能够将人类神经前体细胞分化成多巴胺神经元，因此不仅可以经济地实施分化步骤，而且可以大大改善以往的分化方法带来的令人不满意的分化效率。因此，本专利技术的分化方法可以有效地应用在用于治疗包括帕金森疾病的神经损伤疾病的多巴胺神经元的制备上。附图说明图I示出了在多种培养基组成中向多巴胺神经元诱导分化后，通过二脒基苯基吲哚(DAPI)染色测定TH及Tuji的结果。图2示出了增殖hNPCs，在培养基中添加或不添加IOOii M萎蔫酸，向神经元诱导分化后，测定TH及Tuji的表达量的结果。图3示出了增殖hNPCs，在培养基中添加或不添加IOOii M萎蔫酸，向神经元诱导分化后，实施免疫细胞化学染色分析及RT-PCR分析的结果。图4示出了在改变分化诱导剂种类的培养基中，向多巴胺神经元诱导分化后，测定分化细胞的TH表达的结果。图5示出了在低氧(Hypoxia)条件及常氧(Normoxia)条件下测定的分化效率的结果。图6示出了在MPP存在下诱导分化时，测定萎蔫酸的影响的结果。图7示出了对hNPCs进行增殖及继代培养，分别由初期(第7继代)、中期(第11继代)及后期(第17继代)中得到的hNPCs诱导分化后，测定TH表达量及Tuji表达量的结果。图8示出了对hNPCs进行增殖及继代培养，分别由初期(第7继代)、中期(第11继 代)及后期(第17继代)中得到的hNPCs诱导分化后，通过对各自细胞的免疫染色，测定TH表达的结果。图9示出了对hNPCs进行增殖及继代培养，分别由初期(第7继代)、中期(第11继代)及后期(第17继代)中得到的hNPCs诱导分化后，通过免疫染色，对作为神经干细胞标记的神经巢蛋白、作为增殖性细胞标记的Ki67、及作为成熟神经细胞标记的Tujl的表达进行测定的结果。图10示出了由增殖初期(第7继代)hNPCs诱导分化之前和诱导分化后一周时，进行突光辅助细胞筛选分析(FACS analysis)的结果。图11示出了对hNPCs进行增殖及继代培养，分别由初期(第7继代)、中期(第11继代)及后期(第17继代)中得到的hNPCs诱导分化后，对所得到的细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：文之淑，
申请(专利权)人：车医科学大学校产学协力团，
类型：
国别省市：