本发明专利技术涉及一种快速检测人白细胞抗原B27(HLA-B27)的方法及体外诊断试剂盒，属于医学生物技术领域。该试剂盒采用用一对HLA-B27特异性引物和一条特异性荧光探针快速检测HLA-B27。本试剂盒运用1对HLA-B27特异性引物和1条特异性荧光探针能快速准确检测人外周血等样本中的HLA-B27基因，具有特异性强、敏感性高、省时、省力、成本低廉和高通量等优点，可用于临床强直性脊柱炎、Reiter综合症、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎伴关节病、急性前葡萄膜炎等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病的辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属临床医学生物检测
，具体涉及一种快速人白细胞抗原 B27 (HLA-B27)的试剂盒及检测方法。
技术介绍
在组织或器官移植中，供者与受者之间相容(不排斥)还是不相容(排斥)都是由它们组织特异性所决定的。这种代表个体特异性的组织抗原称组织相容性抗原，一套这样的抗原系统称主要组织相容性系统(major histocompatibility system, MHS)。编码MHS 的基因群称为主要组织相容性复合体MHC即指某一染色体上一群紧密连锁的基因群。人的MHC就称人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，HLA作为抗原研究时，称HLA抗原系统；HLA作为基因研究时称HLA复合体，它位于第6号染色体短臂上 6p21. 3，全长40001Λ。它是为200个以上基因座位组成的基因复合体；是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体；其多态性与疾病的遗传易感性有明显关系。HLA有I类、 II类和III类基因，HLA-B是I类HLA的三个位点(HLA-A、HLA-B, HLA-C)之一。HLA-B27是位于人第6号染色体HLA基因B座位的一个等位基因。强直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis, AS)患者HLA-B27阳性率高达94%，而正常人群仅为9%。对疑似AS患者进行HLA-B27检测，已成为临床重要的辅助诊断手段。目前HLA-B27检测手段主要有血清学方法如微量淋巴细胞毒试验(CDC)、流式细胞仪检测、ELISA法、引物特异性聚合酶链反应(SSP-PCR)等。传统的血清学方法，由于很难获得高质量单价抗血清，单份血清很容易漏检或出现假阳性，而采用多份血清又常常会遇到部分血清阳性时难以判断结果的现象。ELISA法操作繁琐，费时，不利于大批量临床标本检测；流式细胞仪检测具有较高的灵敏度和特异性，但需要配置流式细胞仪，硬件需求高，且检测结果受标本的质量、抗体的效价影响，容易产生假阳性或假阴性。SSP-PCR灵敏度和特异性均较好，但产物需电泳，操作繁琐，且也有一定的假阳性或假阴性。实时焚光定量 PCR 技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法，分染料法和探针法两类检测方法。 探针法实时荧光定量PCR在特异性引物的基础上加入了一条与目的基因特异性匹配的探针(带有荧光基团)，能显著提高检测的特异性，是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。目前已有多种运用探针法定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。本试剂盒通过设计与HLA-B27基因完全匹配的1对特异性引物和1条Taqman水解荧光探针，用于快速准确的检测HLA-B27基因。该方法相比目前应用于临床的其它方法，具有特异性强、敏感性高、省时、省力、成本低廉及高通量等优点，可快速准确的检测患者 HLA-B27基因阴阳性，用于临床强直性脊柱炎、Reiter综合症、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎伴关节病、急性前葡萄膜炎等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病的辅助诊断。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种HLA-B27快速检测的试剂盒。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种HLA-B27快速检测的试剂盒，它包括(1) 1对扩增HLA-B27的特异性引物，其特征在于如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示引物对；条HLA-B27特异性荧光探针，其特征在于如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列， 在其5’端标记荧光报告基团FAM，在其3’端标记荧光淬灭基团TAMRA ；在一次检测中共同使用。上述HLA-B27快速检测的试剂盒，具体包括如下试剂(I)DNA 提取液 A :0. 32M 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1 % (ν/ν) Triton X-100，室温保存；(2) DNA 提取液 B:30mM Tricine pH 8.5，210mM 辛酸钠，2. 5 % (m/v) Chelex-100，_20°C保存；(3)PCR反应液0. 2 μ M引物对SEQ ID NO 1 和 2，0. 04 μ M荧光探针SEQ ID NO :3， 30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明胶，0· 03% (m/v)BSA,6. 5mM MgCl2, _20°C保存；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)阳性对照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存；(6)阴性对照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存。一种HLA-B27快速检测的试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括(1) 1对扩增HLA-B27的特异性引物，其特征在于如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5 所示引物对；条HLA-B27特异性荧光探针，其特征在于如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列， 在其5’端标记荧光报告基团FAM，在其3’端标记荧光淬灭基团TAMRA ；在一次检测中共同使用。上述HLA-B27快速检测的试剂盒，具体包括如下试剂(I)DNA 提取液 A :0. 32Μ 蔗糖，IOmM Tris-HCl pH 7. 5,5mM MgCl2,0. 1 % (ν/ν) Triton X-100，室温保存；(2) DNA 提取液 B :30mM Tricine pH 8.5，210mM 辛酸钠，2. 5 % (m/v) Chelex-100，_20°C保存；(3) PCR 反应液0. 2μ M引物对 SEQ ID NO :4 和 5，0. 04 μ M 荧光探针 SEQ IDNO :6， 30mM Tricine pH 8. 9,0. 05% (v/v)Tween-20,0. 01% (m/v)明胶，0· 03% (m/v)BSA,6. 5mMMgCl2, _20°C保存；(4) 5U/ μ ITaq DNA 聚合酶，_20°C保存；(5)阳性对照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存； (6)阴性对照品 IOOng/ μ 1,-20 V保存。上述HLA-B27快速检测的检测方法包括如下步骤(1)提取外周血人基因组DNA ；(2)以步骤⑴所得DNA为模板，利用特异性引物和荧光探针进行HLA-B27的检测；(3)参考阴阳性对照品，得出临床标本HLA-B27结果。步骤⑵中所述的荧光定量PCR检测体系为PCR反应液(0.2μΜ引物对SEQ IDNO I本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：商纯尔，张伟林，
申请(专利权)人：浙江夸克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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