本发明专利技术公开了一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括：（1）用于检测目的基因的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe，其中，B27-1：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT；B27-2：CGGCGGTCCAGGAGCT；B27-probe：FAM-TACCACCAGGACGCCTAC–TAMRA；（2）用于检测内参基因GAPDH的上下游引物Gapdh-1、Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，Gapdh-1:CAGGTGGAGCGAGGCTAG；Gapdh-2:CTACCCATGACTCAGCTTCTCC；Gapdh–probe:HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。本发明专利技术还提供了一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试剂盒。采用“一管双检”替代了原有的双管检测的方法，增加了一次上机所能检测的样本量，很大程度的提高了检测效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物及试剂盒，采用“一管双检”荧光定量PCR技术，可以有效的节约检测时间，提高检测效率。
技术介绍
强直性脊柱炎(AQ是一种慢性、进行性，中轴关节受累的关节病变，其中以骶髂关节和脊柱关节受累为主要临床表现。该病早期进展较慢，但后期发展较快，很短时间内形成驼背畸形，髋、膝等关节强直。诊断主要建立在影像学检查基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难，容易漏诊或误诊，使很多患者丧失了早期治疗控制病情的时机，更有部分患者因错误或不正规的用药而出现了各种并发症，甚至造成了残疾。故早期诊断显得尤为重要，是争取其良好预后的关键。HLA-B27是一种主要组织相容性复合物I类分子，表达于大多数人类有核细胞和血小板表面。HLA-B27基因定位于人类第6号染色体短臂上，由8个外显子和7个内含子组成。自1973年Brewerton等率先报道，HLA-B27抗原与AS密切相关以来，世界范围内对HLA与疾病的相关性研究与探讨一直不断。不同种族、不同地区人群的研究结果显示， HLA-B27抗原与AS的相关性是迄今已知HLA与疾病相关中最强和最典型的，超过90%的 AS患者其HLA-B27抗原的表达为阳性，普通人群中仅5% 10%的为阳性。对疑似AS患者进行HLA-B27检测有助于提高早期诊断AS的可能性，为此类患者的诊断和鉴别诊断提供线索，可弥补X线不能早期诊断AS的不足。HLA-B27检测还可预测幼年特发性关节炎患儿的转归，如患者HLA2B27阳性，则发展为AS的可能性大。同时HLA-B27抗原检测对 AS的预防亦具有一定意义，如HLA-B27阳性患者的一级亲属可检测B27，对AS进行早期诊断，及早进行干预治疗。目前常用的HLA-B27的检测方法有微量淋巴细胞毒法、流式细胞术(FCM)、 PCR-SSP和实时荧光定量PCR等方法。其中淋巴细胞毒法操作繁琐，相较而言，流式细胞仪以其快速灵敏、多参数特点在临床检测HLA-B27中得到广泛地应用，但由于存在标本不易存放，仪器昂贵等问题，促使我们探索以其他方法进行HLA—B27检测的探索。实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时在线检测，节约了大量的检测时间，避免了遗留污染的发生。2000年有学者开始采用实时荧光PCR对HLA-B27进行基因分型，它在不增加仪器投入的前提下，较淋巴细胞毒法增加了检测效率，较FCM法则降低了对于样本的要求。常见的方法有STOR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。本专利技术申请人于2010年在中国专利申请2010191460 . 7中公开一种用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，采用实时荧光PCR技术结合Allglo探针应用于 HLA-B27基因检测，即采用Allglo探针检测目的基因B27，而检测内参基因的探针是Taqman 探针，由于两种探针的类型不同，采用的是双管检测，即一管检测目的基因B27，一管检测内参基因。一台96孔的荧光PCR仪只可同时检测45份样品，检测效率不高。
技术实现思路
鉴于现有技术中检测HLA-B27方法的不足，在目前已有的“双管”焚光定量PCR检测HLA-B27基因的方法基础上，本专利技术设计了用于检测内参基因GAPDH的上下游引物、探针序列，未改变检测目的基因所用引物及探针序列，但替代原有的Allglo探针，采用同检测内参基因相同类型的Tapman探针，用“一管双检”荧光定量PCR技术检测HLA-B27基因。 采用两条不同通道的荧光基团标记的Tapman探针加入一个PCR反应体系中，通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，实现“一管双检”的要求，开发了一种新型的HLA-B27基因检测试剂盒。一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括(1)用于检测目的基因的上下游引物B27-1、B27-2和探针B27-Probe，其中， B27-1 :GGGTCTCACACCCTCCAGAATB27-2 :CGGCGGTCCAGGAGCTB27-probe FAM-TACCACCAGGACGCCTAC - TAMRA ；(2)用于检测内参基因GAPDH的上下游引物Gapdh-I、Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，Gapdh-I CAGGTGGAGCGAGGCTAGGapdh-2 CTACCCATGACTCAGCTTCTCCGapdh -probe: HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。本专利技术还提供了一种检测人白细胞抗原HLA-B27基因的试剂盒，其特征在于，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述PCR反应液包括 PCR缓冲液；d NTP ；Mg2+ ；检测目的基因用的上下游引物Β27-1、Β27-2和探针B27-Probe ；以及检测内参基因GAPDH用的上下游引物Gapdh-1，Gapdh-2和探针Gapdh-Probe，其中，B27-1 :GGGTCTCACACCCTCCAGAATB27-2 :CGGCGGTCCAGGAGCTB27-probe :FAM_TACCACCAGGACGCCTAC - TAMRA ；Gapdh-1: CAGGTGGAGCGAGGCTAGGapdh-2: CTACCCATGACTCAGCTTCTCCGapdh -probe: HEX-ACCATGCCACAGCCACCACACCTC-BHQ1。进一步地，所述阳性对照品为含有HLA-B27基因组的溶液；所述阴性对照品为无 HLA-B27基因组的溶液。由于HLA-B27各个亚型的序列差异，通过本专利技术设计的上下游引物及探针的特异性，可检测到的亚型为B2701、B2702、B2703、B2704、B2705、B2708、B2709、B2710、B2712、 B2713、B2715、B2716、B2717、B2718、B2722、B2723、B2725、B2726、B2728、B2729、B2731、 B2737、B2738、B2739、B2740、B2742。与 AS 相关的 B2704、B2705 (中国人群中最为多见)、 B2701、B2702、B2703、B2708、B2710、B2714、B2715 亚型都可以检测到。本专利技术的有益效果本专利技术将实时荧光PCR技术结合采用两条不同通道的荧光基4团标记的Tapman探针，实现采用一个PCR反应体系进行目的基因HLA-B27基因检测和内参基因GAPDH检测，是一种新型的用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒。由于采用 “一管双检”替代了原有的双管检测的方法，不但能对与强直性脊柱炎相关的HLA-B27基因亚型进行检测，具有特异性好，灵敏度高，操作简单、等优点，同时降低了检测成本，节约了检测时间，增加了一次上机所能检测的最大样本量，很大程度的提高了检测效率。可用于辅助临床上强直性脊柱炎的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。附图说明图1是使用本专利技术试剂盒检测样品1的结果图。图2是使用本专利技术试剂盒检测样品2的结果图。具体实施例方式本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测人白细胞抗原ＨＬＡ－Ｂ２７基因的专用引物，其特征在于，所述专用引物包括：（１）用于检测目的基因的上下游引物Ｂ２７－１、Ｂ２７－２和探针Ｂ２７－Ｐｒｏｂｅ，其中，Ｂ２７－１：ＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＢ２７－２：ＣＧＧＣＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴ Ｂ２７－ｐｒｏｂｅ：ＦＡＭ－ＴＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＴＡＣ –ＴＡＭＲＡ；（２）用于检测内参基因ＧＡＰＤＨ的上下游引物Ｇａｐｄｈ－１、Ｇａｐｄｈ－２和探针Ｇａｐｄｈ－Ｐｒｏｂｅ，其中，Ｇａｐｄｈ－１：ＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＡＧＧＣＴＡＧＧａｐｄｈ－２： ＣＴＡＣＣＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＧａｐｄｈ –ｐｒｏｂｅ： ＨＥＸ－ＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣ－ＢＨＱ１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方国伟，陈巧妙，李文静，宋坤，
申请(专利权)人：福州艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：35
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