本发明专利技术提供了一种用作质谱检测的双内标志物的寡聚核苷酸对，是利用质谱检测核酸、蛋白、小分子多肽及其它小分子样品时，引入标准样品，即用已知浓度的寡聚核苷酸双内标校正。本发明专利技术还提供该双内标质谱定量方法，其中两条寡聚核苷酸比例在1:1至1:6的区间内，其浓度比例依0.5递增，共设置11个梯度，并利用建立标准曲线的方法，分析MALDI-TOF-MS检测的样品出峰情况。本发明专利技术的产品和方法可以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确性。使得质谱检测时各个峰值更加准确，避免分子量的漂移和物质的量测量误差。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸，蛋白，小分子多肽，及其它小分子样品的定量检测，是一种利用 MALDI-T0F-MS对小片段物质进行检测时，引入已知浓度和比例的寡聚核苷酸作为标准样品，建立标样拟合曲线，用于校正实验误差的方法。
技术介绍
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学、基因组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高通量的分析测试手段，同时也是一种很好的筛选疾病的分子标记方法。MALDI-T0F-MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子， 而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-T0F-MS的准确度高达0. 1°/Γθ. 01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。但由于系统误差等因素影响实验结果的精确定量，因此在质谱检测样品时，引入已知浓度和比例的内标，建立标样拟合曲线，可有效的校正质谱系统误差和分子量偏移。目前曲线拟合的方法在国内外均有较为普遍的应用，Jiangyue Wu等(Anal. Chem. 1997，69，3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的拟合曲线法对环孢菌素进行了定量测试；Mazarin等(Anal. Chem. 2006, 78，2758-2764)结合脉冲梯度旋转核磁共振和 MALDI-T0F-MS定量测定多聚物时，同样采用了拟合曲线进行数据校正；2009年，吕爽等人利用拟合曲线，成功开发了一种磷酸化肽的MALDI-T0F-MS定量方法。
技术实现思路
本专利技术原理是为了在使用MALDI-T0F-MS检测生物分子(如核酸、蛋白、多肽、有机小分子物质等)时，有效克服系统误差，而引入两种已知浓度的寡聚核苷酸作为实验双内标的定量检测方法。基于该原理，本专利技术还专利技术了用于该方法的三组寡核苷酸对。本专利技术的第一个目的是提供用作质谱检测的双内标志物(简称双内标)的寡聚核苷酸对，其选自 LbC/LbT、MbC/MbT 或 HbA/HbG。在一个实施方案中，上述寡核苷酸对分别选自检测低分子量待检物的 LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和 LbT(CTCATCATGCTGCCCT)；或检测中分子量待检物的MbC (CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)禾口 MbT (CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；或检测高分子量待检物的 HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和 HbG(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG)。在一个具体实施方案中，上述LbC/LbT的分子量分别为4753. 04,4768. 05道尔顿， 上述MbC/MbT的分子量分别为6304. 08,6319. 09道尔顿，上述HbA/HbG的分子量分别为 7913. 12,7929. 12 道尔顿。本专利技术的第二个目的是提供一种使用上述寡核苷酸对以用于建立质谱检测的内标标准拟合曲线的方法。在一个实施方案中，所述的方法包括1)合成上述寡聚核苷酸对作为双内标标准品，备用；2)对寡聚核苷酸进行稀释；3)将寡聚核苷酸稀释到不同浓度范围，通过质谱检测得到合适的起始浓度；4)按不同比例将寡聚核苷酸配成混液，质谱检测，对所得到的数据进行分析，建立内标拟合曲线。在一个实施方案中，步骤2的寡聚核苷酸稀释方法既可用常规方法进行稀释，也可使用本专利技术摸索确定的方法。其中，优选是选取相当于IOD26tl的寡核苷酸干粉加500μ 1 水进行稀释，充分振荡溶解，其中所选取寡核苷酸干粉的量的计算方法为寡核苷酸干粉量的摩尔数=1单位寡核苷酸质量/MW ；丽=仏碱基数1312)+ (C碱基数x288)+ (G碱基数(Τ碱基数χ303)-61 ；且 10D260=33 μ g寡核苷酸在一个具体实施方案中，其中步骤2中，为了尽可能减少稀释时带入的误差；用起始 10 μ 1的体积配标样混液(用10 μ 1移液器)。在另一实施方案中，步骤3中适于质谱检测的三组寡聚核苷酸对的起始浓度为 0. 05-0. 6 μ Μ，且各组寡核苷酸对中的HbA/HbG、LbC/LbT、MbC/MbT的浓度比分别为1 :6。在一个具体实施方案中，HbAG (即HbA/HbG)寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0. 3 μ M。在另一具体实施方案中，LbCT (即LbC/LbT)寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.4 μ Μ。在其他具体实施方案中，MbCT (即MbC/MbT)寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0. 05 μ Μ。还在一个实施方案，其中步骤4中根据摸索上述的寡聚核苷酸对梯度稀释的起始浓度，在1 6的区间内，依0. 5递增，共设置11个梯度，做标样拟合曲线。在一个具体实施方案中，其中每种寡聚核苷酸对标准品比例设置3次重复。在其他的实施方案中，前述任一方法中所述质谱为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。本专利技术第三个目的是使用上述寡核苷酸对以用于质谱检测生物分子的方法，包括前述任一方法中的步骤(1)-(4)；步骤(5)根据所建立的内标拟合曲线，用于质谱检测生物分子。附图说明图1为3种不同分子量的寡聚核苷酸质谱检测结果，横坐标为分子量，纵坐标为信号强度；图2A-2C为1 :6配比的3对寡聚核苷酸质谱检测结果，横坐标为分子量，纵坐标为信号强度。图3为内标拟合曲线，横坐标为实际比例，纵坐标为理论比例；斜线为实际比例和理论比例的相似程度。技术效果1.本专利技术的创新点在于摸索出了适合质谱检测的寡聚核苷酸对HbA/HbG、LbC/LbT、 MbC/MbT浓度(0. 05-0. 6 μ Μ,其中具体分别为0.4,0.3,0. 05 μ Μ),并建立了拟合曲线，可作为内标用于质谱检测，有效校正系统误差，实现定量检测。2.本专利技术具有成本低(合成普通寡聚核苷酸)、灵敏度高，检测周期短等优点。具体实施例方式现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本专利技术。但是应当理解， 下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本专利技术总体的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例本例中，将寡聚核苷酸干粉经加水稀释后，配置成不同的浓度和比例，进行质谱检测。目的是在MALDI-T0F-MS采集数据时，用内标校正，使得各个峰值更加准确。由于内标分子量已知，软件分析系统利用已知的分子量对其他峰值进行自动校正。实验材料(1)寡聚核苷酸干粉由寡聚核苷酸合成公司合成(2)384 孔板(AXYGEN)(3)枪头(AXYGEN)(4)EP 管(Eppendorf)(5)芯片(Sequenom) 仪器设备(1)离心机(Bioyong)(2)移液器(Eppendorf)(3)微量紫外分光光度计SMA1000(4)本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用作质谱检测的双内标志物（简称双内标）的寡聚核苷酸对，其分别选自：检测低分子量待检物的ＬｂＣ（ＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣ）和ＬｂＴ（ＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴ）；检测中分子量待检物的ＭｂＣ（ＣＣＣＣＡＴＣＴＡＡＧＣＧＣＡＴＣＡＡＡＣ）和ＭｂＴ（ＣＣＣＣＡＴＣＴＡＡＧＣＧＣＡＴＣＡＡＡＴ）；和检测高分子量待检物的ＨｂＡ（ＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡ）和ＨｂＧ（ＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＧ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，张海燕，邢双艳，
申请(专利权)人：马庆伟，
类型：发明
国别省市：43
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