快速检测基因组中基因拷贝数的方法技术

快速检测基因组中基因拷贝数的方法，包括以下操作步骤：1）选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqManPCR引物和探针；2）用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3）将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4)提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物DNA检测技术，特别是一种。
技术介绍
在现代的科学研究和生产实践中，我们有时需要准确地知道生物体的基因拷贝数。比如，人类脊柱肌肉萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)的遗传病因是一对SMA 基因中的一个部分缺失。我们需要准确地知道其基因的拷贝数，才能做出正确的诊断。又如，随着转基因技术在农业生产中的应用，各个国家对转基因生物采取了严格的控制，研究者必须准确地知道目标基因在转基因植物中的拷贝数。现行测定基因拷贝数的方法有三种1、生物杂交法。将转基因植物与非转基因植物相互杂交，根据子代中转基因植物的比率和孟德尔定律，推算出目标基因在转基因植物中的拷贝数。2、Southern印迹法。将转基因植物的DNA用限制性内切酶水解，然后用琼脂糖凝胶电泳将DNA按片段大小分开，再将其转移到硝酸纤维或尼龙膜上。将目标基因用放射性同位素或其他方法标记，然后和印到膜上的DNA杂交。根据放射性条带的数值，推断出目标基因的拷贝数。3、实时PCR法。实时PCR又称TaqMan PCR,它用一对基因的PCR引子和探针以及DNA聚合酶，通过反复的热冷循环，将目标基因以指数形式扩增。由于PCR产物可以用荧光来定量，而且荧光阈值循环数(Threshhold Cycle, Ct)与被扩增基因的起始浓度对数是直线负相关的，因此我们可以用目标基因和已知内参照基因的Ct差值来确定目标基因的基因拷贝数。现有技术的最明显的缺陷在于1、用时长，耗资大。上述生物杂交法需要一个整个植物生长季才能产生子一代，并需要检测大量的子一代才可以获得有统计意义的数据。2、 需特殊设备和装置。上述Southern印迹法需要放射性同位素操作许可和暗房等基础设施和条件，还需要大量资金处理放射性废物。非放射性方法很难达到检测单一基因的灵敏度， 且价格昂贵。3、基于不充分的假设。上述实时PCR 2ΔΔα法基于一个不充分的假设，即目标基因和内参照基因具有同样的PCR扩增系数。但这项假设一般难以成立，不同序列和长度的基因，其PCR扩增系数都有差异。由于PCR是以指数方式扩增基因的，微小的PCR扩增系数差异会在多个循环扩增后造成PCR扩增的巨大差异，直接影响基因拷贝数的计算。4、基于不充分的试验条件。现有实时PCR测定基因拷贝数的方法，都需要生物标准品，标准品中含有已知拷贝数的目标基因和内参照基因，然后用实验样品同标准品比较，方可得出其目标基因的拷贝数。但这对于一个新物种或新的目标基因非常难于实现。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术之不足，提供一种。本专利技术的目的按照下述方案实现，包括以下操作步骤1)选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqMan PCR引物和探针；2)用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3)将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4)提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比；所述目标基因和内参照基因的标准摩尔浓度溶液是由PCR扩增并纯化制成的； 所述不同摩尔浓度比的目标基因/内参照基因标准混合液，是由权利要求2的目标基因和内参照基因的标准摩尔浓度溶液按比例相混制成的；目标基因/内参照基因的标准曲线，是由目标基因和内参照基因阈值荧光循环数的差值与目标基因和内参照基因摩尔浓度比的对数值对应形成的；提取并纯化生物体的DNA，用实时PCR测定其目标基因和内参照基因的阈值荧光循环数，并根据权利要求4的标准曲线来确定目标基因和内参照基因的基因拷贝数比值。本专利技术对实时PCR测定基因拷贝数的方法做出了重大改进。它将不再拘于现行的简单假设-所有PCR都具有相同的扩增系数，而是基于实验模拟，这从根本上解决了测定基因拷贝数的理论基础问题。同时它也将不再需要一个已知目标基因和内参照基因拷贝数的标准品，解决了如何获取第一个标准品的难题。本专利技术的具体步骤如下1、选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqMan PCR引物和探针；2、用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3、将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4、提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比。因为内参照基因的拷贝数是已知的，我们可以由此可以得知目标基因在该生物体中的拷贝数。附图说明图1.本专利技术方法图解图2. TaqMan PCR的反应机理图3.不同量DNA的TaqMan PCR反应。DNA经过系列稀释，然后加入iTaqMan PCR 反应试管中，与探针反应。不同量的DNA需要不同的PCR循环方可产生可测荧光(该PCR循环数称为Ct或阈值循环数);起始DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循环方可产生可测荧光。图4.基因浓度与TaqMan PCR阈值荧光循环数的关系。图 5. ACt (Ct,HvNHXl - Ct，MsCycl)与摩尔浓度比对数{Log2(HvNHXl/MsCyclX} 相关性的标准曲线。图 6. ACt (Ct，HvNHXl - Ct，MsNHXl)与摩尔浓度比对数{Log2 (HvNHXl/ MsNHXl)}相关性的标准曲线。图 7. ACt (Ct，MsCycl - Ct，MsNHXl)与摩尔浓度比对数{Log2 (MsCycl/ MsNHXl)}相关性的标准曲线。具体实施例方式参照表1.转基因紫花苜蓿的内参照基因MsCycl和MsNHXl以及转基因HvNHXl 的阈值荧光循环值。表2.确定生物体中的基因拷贝数。本专利技术的具体步骤如下以自构建的转基因紫花苜蓿为例。在转基因紫花苜蓿中，目标基因大麦钠氢离子对流泵(HvNHXl)被农杆菌Ti质粒引入紫花苜蓿基因组中，我们需要检测该基因在紫花苜蓿基因组中的拷贝数。在紫花苜蓿中，细胞周期蛋白1 (MsCycl)和紫花苜蓿钠氢离子对流泵1 (MsNHXl)已经被前人用Southern Blot方法证明是单拷贝基因，我们用它们作为内参照基因。我们从商业机构订制了 TaqMan探针和PCR引子，如下HvNHXl TaciMan 探针5，FAM-TGGAAATTTGCTAGTGACAGCCCTGGC-3，Iowa Black MsCycl TaqMan 探针5' FAM-AAGCTTCAGTTGGTTGGTTTAGTGGCAATG-3' Iowa Black MsNHXl TaqMan 探针5，FAM/TTCCTGTAGAACCTGGCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．快速检测基因组中基因拷贝数的方法，包括以下操作步骤：１）选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ引物和探针；２）用ＰＣＲ反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；３）将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时ＰＣＲ仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；４）提取并纯化所测生物体ＤＮＡ，用实时ＰＣＲ仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：计皖，李健，柳金凤，
申请(专利权)人：宁夏林业研究所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：64