一种蛋白质变化程度检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供的一种蛋白质变化程度检测方法，包括以下步骤：利用三重四级杆质谱仪质谱定量检测生理、病理不同期间的同一目标蛋白质的肽片段；根据质谱结果，将同一目标蛋白质的肽片段归类；根据同一目标蛋白质的不同类别的肽片段之间的比例关系，确定蛋白质变化程度。该方法是一种全新的方法，属于开拓性的发明专利技术，其能够定量的检测蛋白质内部各个肽片段变化程度，从而在肽片段水平上反应生物体细胞内的病理、生理过程。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质变化程度检测方法及其应用
本专利技术属于生物检测领域，特别涉及一种对蛋白质变化程度的分析方法，还涉及该方法在发现新的病理、生理过程标志物中的应用，还涉及该方法在评估生物样品腐败程度中的应用。
技术介绍
液相色谱仪与串联质谱仪联用(LC-MS/MS)技术发展迅速，是当今世界上最为先进的灵敏、准确的蛋白质分析平台。其中，近年来发展起来的三重四级杆质谱仪是将三组四级杆质谱仪串联使用，组与组之间是递进的质谱选择关系，通过选择性反应监测模式(SRM)与多反应监测模式(MRM)，可以对蛋白质内具有代表性的肽片段的质量与带电荷比值(m/z值)特性进行选择，从而从复杂的蛋白混合物中滤过众多本底干扰，专一地检测选定的蛋白质，这使得此蛋白质检测平台更具专一性和灵敏性。另外，在选定有代表性的肽片段以后，可以人工合成与该肽片段序列完全一致但标记有同位素的标准品，与待测样品以一定比例混合同时注入质谱仪中，由于标准品进样量已知，因而可以将待测样品中所检测到的代表性肽片段丰度与标准品丰度作比较，以反映待测样品中选定蛋白的绝对摩尔含量。如上所述的蛋白定量质谱技术被自然杂志的技术分刊(NatureMethods)评为2012年最佳技术。然而，短暂的技术发展史使该技术仍有很多不完善之处。目前国内、外对该技术的应用，主要是用来测量在各个领域已经被证明有重要价值的蛋白在样品中的摩尔含量。除此以外，该技术还被利用于检测蛋白质在某些位点的修饰等。但是，以上所述的蛋白定量质谱技术无一例外地将检测对象局限于“蛋白水平”，而忽略了该技术本质上是提供了丰富的“亚蛋白水平”(肽片段)的数据，也就是说，该技术在一般情况下只是选择出能够代表相应蛋白的某个(些)肽片段，而忽略了其他肽片段的应用价值。而事实上，这些“亚蛋白水平”的数据在常规质谱分析时已经存在，这些数据为研究蛋白内部各个肽区段的独立特征提供了完美的资料。血、病理标本等生物样本离体后失去养氧供给不可避免地发生组织腐败、生物分子降解，在医学临床工作中，这些腐败降解可直接引发误诊、误治。然而目前尚没有任何技术手段可以反映生物样品发生的腐败降解程度。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种蛋白质变化程度检测方法及其应用。技术方案：本专利技术提供的一种蛋白质变化程度检测方法，包括以下步骤：(1)利用三重四级杆质谱仪质谱定量检测生理、病理不同期间的同一目标蛋白质的肽片段；(2)根据质谱结果，将同一目标蛋白质的肽片段归类，见图1：I型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度减少或增多；肽片段丰度减少主要由于蛋白被降解为肽片段后，该肽片段对次级蛋白酶易感，继而被分解为氨基酸，从而从质谱结果中消失所致；而肽片段丰度增多主要由于该蛋白表达增加而致；II型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度相对恒定；肽片段丰度相对恒定主要因为该蛋白随生理、病理期间变化不敏感，或由于该肽片段对次级蛋白酶不敏感所致；III型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度减少，同时具有氨基酸修饰的质谱特征的新肽片段丰度增加；变化主要由于该肽片段上氨基酸修饰(如磷酸化、去磷酸化等)的变化所致；IV型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度减少，同时具有切割质谱特征的新肽片段丰度增加；变化主要由于蛋白酶切割原肽片段所致；(3)根据同一目标蛋白质的不同类别的肽片段之间的比例关系，确定蛋白质变化程度。本专利技术提供的蛋白质变化程度检测方法，是一种以质谱为手段分析肽片段与生物体细胞内的病理、生理过程相关关系的“亚蛋白水平”的研究方法。申请人的研究发现，生物样本中的某些蛋白质随着生物样本整体腐败程度的加重，自身降解加剧，因而这些蛋白质可以作为样本腐败的指示剂和标志物。值得重视的是，在对这些腐败标志物的“亚蛋白水平”的质谱分析时发现，在标本腐败、标志物蛋白降解的过程中，这些标志物蛋白内部的肽片段之间并非同时、同速地在质谱分析中消失，而是某些肽片段被蛋白酶识别，渐进性地降解成氨基酸而逐渐从质谱检测中消失，而另一些肽片段却能够抵抗次级降解，继续在质谱检测结果中长时间存在。在这种情况下，“亚蛋白水平”的质谱分析不但可以利用那些渐进性降解的肽片段作为样本腐败的标志物，而且由于有其他“恒量”肽片段作为内参，“亚蛋白水平”的质谱分析甚至可以在不使用标准品的情况下，直接以“渐进性降解肽片段”与“恒量肽片段”的比值作为指标对标本腐败程度作出定量评价。“亚蛋白水平”的定量研究在生物、医学领域具有独特的应用价值。该方法的原理为：首先，按照研究者所关心的病理、生理过程设立生物模型，生物模型的特征表现为一系列强度逐渐加剧的病理、生理条件，因此可特征性的体现肽片段与生物体细胞内的病理、生理过程相关关系；例如，对于生物样品腐败模型，需要包括从无腐败、早期腐败、到晚期腐败、完全腐败等一系列观察组别。其次，对生物模型的各个观察组别所产生的蛋白混合物进行全面分析，筛选出典型蛋白模型，典型蛋白模型应当与模型相关的具有肽片段失衡现象，从而能够特征性的体现其肽片段与生物体细胞内的病理、生理过程相关关系。再次，对各观察组的典型蛋白模型中所有肽片段的丰度平衡进行分析，推测肽片段降解或者修饰所产生具有新质谱特征的新片段的可能性，并由质谱数据中搜寻所推测的新片段的质谱特征，从而对肽片段进行正确分类，找出丰度平衡不均、并且丰度失衡程度随模型条件强度改变而有序改变的蛋白质。典型蛋白模型内部的所有肽片段在病理、生理模型中的变化，可以表现为四型肽片段的变化中的一种，也可以几种变化同时存在；当几种形式的肽片段变化同时存在于某一蛋白时，肽片段之间的平衡在不同观察组别中必然被打破，使研究“亚蛋白水平”肽片段与生物体病理、生理过程关系成为可能。最后，不同肽片段相互之间可以形成客观的内部参照物，如I型肽片段与II型肽片段之间、III和IV型肽片段新片段与原始片段之间的丰度比例，可以直接被用于作为指示病理、生理过程的指标；内参是在“亚蛋白水平”研究生物体病理、生理过程的特有优势。此外，对于重点肽片段还可进行标准化定量质谱分析：在选定重点肽片段以后，将合成与该肽片段序列完全一致但标记有同位素的标准品，定量的标准品将与待测样品混合同时注入质谱仪中，在选择性反应监测模式(SRM)与多反应监测模式(MRM)下按照其质谱特征对重点肽片段及其标准品进行选择性的定量质谱分析，由于标准品进样量已知，因而可以将待测样品中所检测到的代表性肽片段丰度与标准品丰度作比较，可以换算出待测样品中重点肽片段的绝对摩尔含量。本专利技术还提供了上述蛋白质变化程度检测方法在生理过程检测中的应用。本专利技术还提供了上述蛋白质变化程度检测方法在细胞腐败程度检测中的应用。本专利技术还提供了一种细胞腐败程度检测方法，以胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度比例，作为指示细胞腐败程度的指标。本专利技术还提供了一种细胞腐败程度定量检测方法，包括以下步骤：制备标记的与胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段序列完全一致的两段肽片段作为标准品，将定量的标准品与腐败程度待测样品混合在三重四级杆质谱仪中，在选择性反应监测模式与多反应监测模式下按照其质谱特征对胞衬蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质变化程度检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）利用三重四级杆质谱仪质谱定量检测生理、病理不同期间的同一目标蛋白质的肽片段；（2）根据质谱结果，将同一目标蛋白质的肽片段归类：I型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度减少或增多；II型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度相对恒定；III型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度减少，同时具有氨基酸修饰的质谱特征的新肽片段丰度增加；IV型肽片段：随生理、病理期间变化，肽片段丰度减少，同时具有被蛋白酶切割质谱特征的新肽片段丰度增加；（3）根据同一目标蛋白质的不同类别的肽片段之间的比例关系，确定蛋白质变化程度。

【技术特征摘要】
1.一种细胞腐败程度检测方法，其特征在于：以胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段之间的丰度比例，作为指示细胞腐败程度的指标。2.根据权利要求1所述的一种细胞腐败程度检测方法，其特征在于：包括以下步骤：制备标记的与胞衬蛋白1153至1181号氨基酸组成的肽片段以及其1153至1176号氨基酸组成的肽片段序列完全一致的两段肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：李捷，
申请(专利权)人：李捷，
类型：发明
国别省市：天津;12