稳定 GPCR 的功能构象状态的蛋白结合结构域及其用途制造技术

本发明专利技术涉及GPCR结构生物学和信号传导领域。具体而言，本发明专利技术涉及针对或能特异性结合G蛋白偶联受体(GPCR)的功能构象状态的蛋白结合结构域。更具体地，本发明专利技术提供能增强GPCR的功能构象状态的稳定性、特别是能增强活性构象状态的GPCR的稳定性的蛋白结合结构域。本发明专利技术的蛋白结合结构域可以用作对结合各种天然和合成配体的G蛋白偶联受体进行结构和功能表征的工具，以及用于以GPCR为目标的筛选和药物发现工作的工具。此外，本发明专利技术还包括这些蛋白结合结构域用于GPCR相关疾病的诊断、预后以及治疗的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及GPCR结构生物学和信号传导领域。具体而言，本专利技术涉及针对或能特异性结合G蛋白偶联受体(GPCR)的功能构象状态的蛋白结合结构域。更具体地，本专利技术提供能增强GPCR的功能构象状态的稳定性、特别是能增强活性构象状态的GPCR的稳定性的蛋白结合结构域。本专利技术的蛋白结合结构域可以用作对结合各种天然和合成配体的G蛋白偶联受体进行结构和功能表征的工具，以及用于以GPCR为目标的筛选和药物发现工作的工具。此外，本专利技术还包括这些蛋白结合结构域用于GPCR相关疾病的诊断、预后以及治疗的用途。
技术介绍
G蛋白偶联受体(GPCR)是人类基因组中最大的膜蛋白家族。它们在对一组多样性的配体的生理应答中发挥至关重要的作用，所述配体如生物胺、氨基酸、肽、蛋白、前列腺素、磷脂、脂肪酸、核苷、核苷酸、Ca2+离子、着嗅齐IJ、较苦和甜的促味齐IJ、信息素以及质子(Heilker et al.2009) XPCR是范围广泛疾病的治疗靶标。GPCR的特征在于，具有细胞外氨基末端和细胞内羧基末端的7个跨膜结构域，并且也称为七跨膜或七螺旋受体(Rosenbaumet al.2009)。视紫红质是高度专业化地有效检测光的GPCR，由于其在牛视网膜中的生化稳定性和天然丰度，其已经成为GPCR信号传导和结构生物学的范例(Hofmann et al.2009)。相比之下，许多GPCR通过调节多种G蛋白同种型的活性以及G蛋白非依赖性信号传导通路(如抑制蛋白)而表现出复杂的功能行为。在一些情况下，GPCR可以表现出针对特异性信号传导通路的基础活性，即使在缺少配体的情况下。作用于GPCR的正位配体能够对下游信号传导通路具有一系列作用。完全激动剂对受体的激活最大。部分激动剂即使在饱和浓度下也引发极限下刺激。反向激动剂抑制基础活性，尽管中性拮抗剂对基础活性没有影响，但是竞争性地阻断其他配体的结合。GPCR针对激素和神经递质的复杂行为可归因于它们的结构可塑性(Kobilka andDeupi, 2007)。来自功能和生物物理研究的证据表明，GPCR可以以多种功能上不同的构象状态存在(Kobilka and Deupi2007)。尽管这种结构可塑性和动态行为对于正常功能是必需的，但是其有助于它们的生化不稳定性和难以获得高分辨率晶体结构。迄今为止，已经报道了人 β 2AR(Rasmussen et al.2007; Rosenbaum et al.2007; Cherezov et al.2007;Hansonet al.2008)、鸟 β (ffarne et al.2008)以及人 A2 腺苷受体(Jaakola et al.2008)的晶体结构。尽管视紫红质可以由分离自天然组织的未修饰蛋白而结晶，但是这些其他GPCR需要在重组系统中表达、通过反向激动剂稳定非活性状态以及生化修饰，以稳定受体蛋白。β 2AR的第一晶体结构通过选择性Fab而稳定(Rasmussen et al.2007)。β 2AR的后继结构和A2腺苷受体在蛋白工程的帮助下获得:将T4溶菌酶插入最初针对β 2AR而描述的第三细胞内环(Rosenbaum et al.2007)。最后，由蛋白生长鸟β AR的晶体,所述蛋白通过氨基和羧基末端截短和第三细胞内环的缺失以及增强纯化蛋白的热稳定性的6氨基酸取代而改造(Warne et al.2008)。获得GPCR活性状态的结构较难，因为这种状态相对不稳定。荧光寿命研究表明，在存在饱和浓度的完全激动剂时，P2AR在结构上是异质的(Ghanouni et al.2001)。这种结构异质性与晶体的形成不相容。β 2AR活性状态的稳定需要存在其同源G蛋白Gs，即腺苷酸环化酶的刺激蛋白(Yao et al.2009)。迄今为止，仅GPCR的活性状态结构是视蛋白的活性状态结构，即视紫红质的配体游离形式(Park et al.2008)。这些晶体在酸性pH(5.5)下生长，其中通过FTIR光谱，已经证明视蛋白与光激活的视紫红质(变视紫红质II)在结构上相似。尽管P2AR在pH降低时也表现出较高的基础活性，但其是生化不稳定的(Ghanouniet al.2000)。阐明与各种天然和合成配体和蛋白复合的GPCR的不同功能构象状态的结构，对于理解GPCR信号转导机制以及基于结构的药物发现努力都是有价值的。因此需要研发用于对GPCR的个体构象异构体进行高分辨率结构分析的新的简单工具。
技术实现思路
本专利技术的第一方面涉及能特异性结合GPCR的功能构象状态的蛋白结合结构域。根据优选的实施方案，所述蛋白结合结构域在结合后，能稳定GPCR的功能构象状态。优选地，所述蛋白结合结构域能在结合后诱导GPCR的功能构象状态。根据另一优选的实施方案，所述GPCR的功能构象状态选自基础构象状态或活性构象状态或非活性构象状态。优选地，所述GPCR的功能构象状态是活性构象状态。根据另一优选的实施方案，所述蛋白结合结构域能特异性结合与激动剂结合的GPCR和/或增强GPCR对激动剂的亲和性。根据另一优选的实施方案，所述蛋白结合结构域在结合后能增强GPCR的功能构象状态的热稳定性。在具体实施方案中，所述蛋白结合结构域能特异性结合所述GPCR的功能构象状态的构象表位。优选地，所述构象表位是细胞内表位。更优选地，所述构象表位包含于用于下游信号传导蛋白的结合位点中。最优选地，所述构象表位包含于G蛋白结合位点中。优选地，本专利技术的蛋白结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补决定区或其任何合适的片段。更优选地，所述蛋白结合结构域来源于骆驼抗体(camelid antibody)。最优选地,所述蛋白结合结构域包含纳米抗体序列或其任何合适的片段。例如，所述纳米抗体包含选自SEQ ID NO: 1-29的序列或其任何合适的片段。根据另一优选的实施方案，所述GPCR是哺乳动物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆虫蛋白。所述哺乳动物蛋白可以是人蛋白。特别是，所述GPCR选自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR视紫红质家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCR Frizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。具体而言，所述GPCR是肾上腺素能受体，如α -肾上腺素能受体或β -肾上腺素能受体,或其中所述GPCR是毒蕈碱受体,如Ml毒蕈碱受体M2毒蕈碱受体或M3毒蕈碱受体或Μ4毒蕈碱受体或Μ5毒蕈碱受体,或其中所述GPCR是血管紧张素受体，如血管紧张素IIl型受体或血管紧张素112型受体。本专利技术的第二方面涉及复合体，所述复合体包含(i)本专利技术的蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体。所述受体配体可以选自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体或其任何合适的片段。所述复合体也可以采用溶解形式或固定化于固相支持物。特别是，所述复合体是晶体。本专利技术还包括晶体形式的复合体，其包含(i)蛋白结合结构域，( )功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体，其中所述晶体形式通过使用本专利技术的蛋白结合结构域而获得。本专利技术的第三方面涉及包含本专利技术的蛋白结合结构域和/或本专利技术的复合体的细胞组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.06 GB 1014715.5;2010.07.16 US 61/399,7811.蛋白结合结构域，其能特异性结合GPCR的功能构象状态。2.权利要求1的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域在结合后能稳定GPCR的功能构象状态。3.权利要求1-2中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域在结合后能在GPCR中诱导功能构象状态。4.权利要求1-3中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR的功能构象状态选自基础构象状态或活性构象状态或非活性构象状态。5.权利要求1-4中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR的功能构象状态是活性构象状态。6.权利要求1-5中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域能特异性结合与激动剂结合的GPCR和/或增强GPCR对激动剂的亲和性。7.权利要求1-6中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域在结合后能增强GPCR的功能构象状 态的热稳定性。8.权利要求1-7中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域能特异性结合所述GPCR的功能构象状态的构象表位。9.权利要求8的蛋白结合结构域，其中所述构象表位是细胞内表位。10.权利要求8-9中任一项的蛋白结合结构域，其中所述构象表位包含于用于下游信号传导蛋白的结合位点中。11.权利要求8-10中任一项的蛋白结合结构域，其中所述构象表位包含于G蛋白结合位点中。12.权利要求1-11中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4个构架区和3个互补决定区或其任何合适的片段。13.权利要求1-12中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域来源于骆驼抗体。14.权利要求1-13中任一项的蛋白结合结构域，其中所述蛋白结合结构域包含纳米抗体序列或其任何合适的片段。15.权利要求14的蛋白结合结构域，其中所述纳米抗体包含选自SEQID ΝΟ:1_29的序列或其任何合适的片段。16.权利要求1-15中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR是哺乳动物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆虫蛋白。17.权利要求16的蛋白结合结构域，其中所述哺乳动物蛋白是人蛋白。18.权利要求1-17中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR选自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR视紫红质家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCR Frizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。19.权利要求1-18中任一项的蛋白结合结构域，其中所述GPCR是肾上腺素能受体，如α肾上腺素能受体或β -肾上腺素能受体，或其中所述GPCR是毒蕈碱受体,如Ml毒蕈碱受体或M2毒蕈碱受体或M3毒蕈碱受体或Μ4毒蕈碱受体或Μ5毒蕈碱受体,或其中所述GPCR是血管紧张素受体，如血管紧张素IIl型受体或血管紧张素Π2型受体。20.复合体，包含(i)蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体。21.权利要求20的复合体，包含(i)权利要求1-19中任一项的蛋白结合结构域，(ii)功能构象状态的GPCR，以及(iii)任选存在的受体配体。22.权利要求20-21中任一项的复合体，其中所述受体配体选自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·斯泰亚特，E·帕尔东，S·拉斯穆森，J·冯，B·科比尔卡，T·莱里曼斯，
申请(专利权)人：弗拉芒区生物技术研究所，布鲁塞尔自由大学，利兰斯坦福初级大学董事会，
类型：
国别省市：