改造的构象稳定蛋白质制造技术

本文提供构象稳定的遍在蛋白；及用该构象稳定的遍在蛋白来鉴定结合稳定的遍在蛋白的物质，或结合与稳定形式的遍在蛋白相互作用的蛋白质的物质，或加工稳定形式的遍在蛋白的蛋白质的物质的方法。本文还提供用于筛选构象稳定的蛋白质的方法，与野生型形式的蛋白质和结合配偶体的结合亲和力相比，该构象稳定的蛋白质具有提高的和结合配偶体的结合亲和力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2012年3月16日提交的美国临时专利申请号61/612,228的优先权，其公开内容在此完整引入作为参考。
本文提供用于筛选和使用构象动态蛋白质的构象稳定形式，如构象稳定的遍在蛋白(ubiquitin protein)的方法，以及包含此构象动态蛋白质的构象稳定形式的组合物。
技术介绍
蛋白质是非常动态的大分子，构象运动在多种过程中发挥作用，如产生机械能、进行酶促反应和介导信号转导。由于分子的多种状态可以执行不同的功能，对产生特异性识别离散构象状态的试剂的能力存在相当大的兴趣。1,2遍在蛋白(ubiquitin)是见于真核生物的几乎所有组织中(遍在地)的小调节蛋白。蛋白质遍在蛋白化介导许多细胞过程，如细胞周期控制、凋亡、表观遗传学和转录调节。4但是，遍在蛋白最广为人知的可能是它在标记将要通过细胞的蛋白水解机器破坏和回收的蛋白质中发挥的作用。在遍在蛋白共价“标记”蛋白质时，遍在蛋白分子将蛋白质定向至蛋白酶体，蛋白酶体是细胞中降解和回收标记待破坏的蛋白质的大的多成分蛋白复合物。遍在蛋白本身由76个氨基酸组成，分子量约为8.5kDa。主要特征包括其C端尾和7个赖氨酸残基。6遍在蛋白的氨基酸序列在真核物种间保守，人和酵母遍在蛋白具有约96％序列同一性。在哺乳动物中，遍在蛋白由4个分开的基因编码。基因UBA52和RPS27A分别编码与核糖体蛋白L40和S27a融合的单拷贝遍在蛋白，而UBB和UBC基因编码多聚遍在蛋白前体蛋白。遍在蛋白化是酶促的翻译后修饰过程，其中来自活化的遍在蛋白形式的遍在蛋白C端二甘氨酸基序的末端甘氨酸与修饰蛋白质中赖氨酸残基的ε胺形成酰胺键。遍在蛋白由E1遍在蛋白活化酶在需要ATP作为能量来源的过程中以两步反应活化。这涉及产生遍在蛋白-腺甘酸中间体，然后将遍在蛋白转移至E1活性部位半胱氨酸残基，在遍在蛋白C端羧基和E1半胱氨酸巯基之间产生硫酯键。然后，通过转(硫)酯反应将遍在蛋白从E1酶转移至E2遍在蛋白缀合酶的活性部位半胱氨酸。遍在蛋白化酶级联最后的步骤在靶蛋白中的赖氨酸和遍在蛋白的C端甘氨酸之间产生异肽键。通常，此步骤需要数百种已知的E3遍在蛋白-蛋白连接酶(常简称为“遍在蛋白连接酶”)之一的活性。5E3酶作为该系统的底物识别模块发挥作用，且能够与E2和修饰的蛋白底物二者相互作用。单个遍在蛋白加至蛋白质(单遍在蛋白化)之后，可以在它的7个赖氨酸残基中的一个或多个上将其他遍在蛋白加至该第一遍在蛋白分子，产生多聚遍在蛋白链。此外，一些底物是通过在称为多遍在蛋白化的过程中将遍在蛋白分子加至多个赖氨酸残基来修饰。研究最多的多聚遍在蛋白链是用于蛋白酶体中的蛋白酶解的赖氨酸48连接的靶蛋白。为了能被细胞的蛋白水解机器识别，将要降解的蛋白质必须通过至少四个遍在蛋白分子修饰。遍在蛋白分子在破坏(destruction)前由隶属于遍在蛋白C末端水解酶(UCH)家族脱遍在蛋白酶(deubiquitinase)的酶从蛋白质切下并回收用于其他用途。脱遍在蛋白酶(DUB)是一类通过去组装遍在蛋白链或从底物去除单遍在蛋白化来调节遍在蛋白介导的信号发放的特化蛋白。7DUB还常称为脱遍在蛋白肽酶、脱遍在蛋白异肽酶、脱遍在蛋白酶、遍在蛋白蛋白酶、遍在蛋白水解酶、遍在蛋白异肽酶或Dub。人基因组在五个基因家族中编码近100种对遍在蛋白具有特异性的DUB。DUB可以作为遍在蛋白系统的负调节物和正调节物。除遍在蛋白回收外，它们还涉及遍在蛋白前体的最初加工、蛋白质遍在蛋白化的校正及抑制性遍在蛋白链的去组装。此外，诸如遍在蛋白特异性蛋白酶(USP)家族DUB的DUB逆转靶蛋白的遍在蛋白化或遍在蛋白样修饰，而诸如UCH家族DUB的成员的DUB负责从未锚定的多聚遍在蛋白(即通过缀合机从头合成或通过其他DUB从靶蛋白释放的游离多聚遍在蛋白)再生单遍在蛋白。大多数DUB尚未得到充分表征。一个例外是USP7(HAUSP)，其在肿瘤发生中具有已经确定的作用。USP7的关键功能是通过脱遍在蛋白化和稳定癌蛋白质Mdm2从而下调p53肿瘤抑制物来调节细胞存活。8,9由于USP7直接去稳定化p53并调节其他肿瘤抑制物(包括FOXO4和PTEN)，抑制USP7是有吸引力的治疗策略。8,9另一实例是USP14，认为其在降解涉及淀粉状蛋白生成性神经变性的蛋白质中发挥作用。32本文引用的所有专利、专利申请、出版物、文件、核苷酸及蛋白质序列数据库检索号、其所指的序列和文章在此全都以其整体引入作为参考。专利技术概述本文提供的专利技术尤其公开了包含构象稳定的遍在蛋白的组合物和用该组合物来抑制与这些蛋白质的稳定形式结合的一种或多种酶的作用的方法，以及用于鉴定与这些稳定蛋白质结合的物质的方法。本文还提供用于筛选蛋白质的构象稳定形式的方法。在一方面，本申请提供相对于野生型遍在蛋白具有一个或多个氨基酸取代的构象稳定的遍在蛋白。在一些实施方案中，该一个或多个氨基酸取代稳定该构象稳定的遍在蛋白的β1/β2环，使该β1/β2环限制于蛋白质数据库(Protein Data Bank)编号3NHE链B的约均方根偏差内的区域。在一些实施方案中，如通过NMR R2分散(dispersion)所测量，与野生型遍在蛋白相比，该构象稳定的遍在蛋白的β1/β2环区显示更慢的构象动态。在上述实施方案中任一个的一些实施方案中，如通过NMR R2分散所测量，与野生型遍在蛋白相比，构象稳定的遍在蛋白的β1/β2环附近区域中的微秒Rex值高至多40倍。在上述实施方案中任一个的一些实施方案中，该构象稳定的遍在蛋白在选自A7、A8、A13、A34、A36、A69和A71的位置处包含一个或多个氨基酸取代，其中该位置是相对于A1-A76(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，该构象稳定的遍在蛋白包含(a)取代A7(C)或取代A8(C)；和(b)取代A69(C)。在一些实施方案中，该构象稳定的遍在蛋白进一步包含选自A13(N、R、G、K、Y、A、S、H、E、L、T、V、I、M或P)、A34(I、F、L、V、S、M或T)、A36(Y、F、L、H、A、V、W、I、M或N)和A71(R、K、A、Q、W、G、H、I、R或G)的一个或多个取代。在一些实施方案中，该构象稳定的遍在蛋白包含选自A7(D、F、R或S)、A8(Y、A、G、Q、R或Y)、A13(R、Y、E或P)、A34(I、L或T本文档来自技高网...

【技术保护点】
构象稳定的遍在蛋白，其相对于野生型遍在蛋白包含一个或多个氨基酸取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.16 US 61/612,2281.构象稳定的遍在蛋白，其相对于野生型遍在蛋白包含一个或多个氨
基酸取代。
2.权利要求1的构象稳定的遍在蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取
代稳定蛋白质的β1/β2环，使得β1/β2环限制于蛋白质数据库编号3NHE
链B的约均方根偏差内的区域。
3.权利要求1或2的构象稳定的遍在蛋白，其中如通过NMR R2分散
所测量，与野生型遍在蛋白相比，所述蛋白质的β1/β2环区显示更慢的构
象动态。
4.权利要求1-3中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中如通过NMR
R2分散所测量，与野生型遍在蛋白相比，所述β1/β2环周围的区域中的微
秒Rex值高至多40倍。
5.权利要求1-4中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中所述蛋白质在
选自A7、A8、A13、A34、A36、A69和A71的位置处包含一个或多个氨
基酸取代，其中位置相对于A1-A76(SEQ ID NO:1)。
6.权利要求5的构象稳定的遍在蛋白，其包含(a)取代A7(C)，或取
代A8(C)；及(b)取代A69(C)。
7.权利要求6的构象稳定的遍在蛋白，其进一步包含选自A13(N、R、
G、K、Y、A、S、H、E、L、T、V、I、M或P)、A34(I、F、L、V、S、
M或T)、A36(Y、F、L、H、A、V、W、I、M或N)和A71(R、K、A、
Q、W、G、H、I、R或G)的一个或多个取代。
8.权利要求5的构象稳定的遍在蛋白，其包含选自A7(D、F、R或
S)、A8(Y、A、G、Q、R或Y)、A13(R、Y、E或P)、A34(I、L或T)、
A36(L、Y、A或N)、A69(A、G、W、K、Y或I)和A71(A、R、Q、R
或G)的一个或多个取代。
9.权利要求5-8中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其进一步包含定位
在A42、A46、A49、A62、A65、A68或A70处的一个或多个氨基酸取代，

\t其中氨基酸残基位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
10.权利要求5-9中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其进一步包含定
位在A40、A42、A46、A47、A49、A62、A65、A68、A70、A71、A72、
A73、A74、A75或A76处的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸残基位
置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
11.权利要求1-10中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中与野生型遍
在蛋白相比，构象稳定的遍在蛋白显示与遍在蛋白特异性蛋白酶(USP)家
族的脱遍在蛋白酶的结合增加。
12.权利要求1-11中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中构象稳定的
遍在蛋白以纳摩尔范围内的Kd与脱遍在蛋白酶结合。
13.权利要求1-12中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中构象稳定的
遍在蛋白以比野生型蛋白质的亲和力高至少1000倍的亲和力与脱遍在蛋
白酶结合。
14.权利要求1-13中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中构象稳定的
遍在蛋白抑制脱遍在蛋白酶的活性。
15.权利要求1-14中任一项的构象稳定的遍在蛋白，其中与野生型遍
在蛋白相比，构象稳定的遍在蛋白显示与遍在蛋白C端水解酶(UCH)家族
的脱遍在蛋白酶无结合或结合减少。
16.核酸，其编码权利要求1-15中任一项的构象稳定的遍在蛋白。
17.载体，其包含权利要求16的核酸。
18.权利要求17的载体，其中载体是表达载体。
19.细胞，其包含权利要求15的核酸，或权利要求17或18的载体。
20.权利要求19的细胞，其中细胞选自动物细胞、细菌细胞、昆虫细
胞、线虫细胞和酵母细胞。
21.权利要求20的细胞，其中动物细胞是人细胞或非人细胞。
22.蛋白复合物，其包含权利要求1-15中任一项的构象稳定的遍在蛋
白，和USP家族的成员的脱遍在蛋白酶。
23.权利要求22的蛋白复合物，其中脱遍在蛋白酶是USP7、USP5

\t或USP 14。
24.权利要求23...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·E·科恩，Y·张，A·H·菲利普斯，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH