【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质聚集物与单体分离中作为结合试剂的带正电物质
技术介绍
蛋白质错折叠是细胞中的正常现象。然而，错折叠蛋白倾向于自我结合，形成不同大小和结构的蛋白聚集物。由于持续性错折叠蛋白可导致毒性聚集物，细胞含有减少细胞中错折叠蛋白量的途径和机制。错折叠蛋白中间体由辅助中间体正确折叠的分子伴侣识另IJ。如果错折叠蛋白逃避分子伴侣的修正，泛素-蛋白体途径通常将它们降解。错折叠蛋白积聚与多种疾病相关联。蛋白质构象病包括多种临床非相关疾病，如感染性海绵状脑病、阿尔茨海默病、ALS和糖尿病，所述疾病由正常蛋白异常构象转化成致病性构象异构体引起。此转化可进而导致伴有后续组织沉积的致病性构象异构体自结合成较小的聚集物如寡聚体或较大的聚集物如原纤维，并推测引起周围组织损伤。已证实难以检测活对象和获自活对象的样品中的构象病蛋白聚集物。确认病人中 存在聚集物的现行技术是粗糙和侵入性的。例如，组织病理学检测需要的活检对所述对象有风险。组织病理学本身易产生抽样误差，因为根据取活检的区域可能错过聚集的致病性构象异构体的损伤和沉积。因此，在对象死亡前明确诊断和舒缓治疗这些病症仍是尚未解决的挑战。β -淀粉样蛋白(Α β )聚集物，主要是A β 1-40 (Α β 40)和1-42 (Α β 42)的沉积与阿尔茨海默病(AD)全面相关并被认为是该疾病的最佳标记物。然而，AD的唯一确定性试验是免疫组化染色来自死后脑样品的纤维Αβ聚集物斑。目前，对于AD没有FDA批准的生前诊断试验。血浆或CSF样品可用于生前试验。一些生前AD试验着重于脑脊液(CSF)并尝试定量可溶性单体A β 42。然而，该生物标记仅...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.04 US 61/258,188;2009.11.30 US 61/265,3401.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，如果存在所述聚集物则形成复合物；和 通过所述被疑存在的聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述聚集物的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。2.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成复合物的条件下接触； 将所述复合物与构象蛋白特异性结合试剂在允许结合的条件下接触；和通过所述被疑存在的聚集物与所述构象蛋白特异性结合试剂的结合，检测所述聚集物的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在形成所述复合物后去除未结合的样品。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构象蛋白特异性结合试剂是抗体。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括Αβ蛋白且所述构象蛋白特异性结合试剂是抗A β抗体。6.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成第一复合物的条件下接触； 去除未结合样品； 从所述第一复合物中脱离所述聚集物从而提供脱离聚集物； 将所述脱离聚集物与第一构象蛋白特异性结合试剂在允许结合形成第二复合物的条件下接触；和 通过检测所述第二复合物的形成，检测所述被疑存在聚集物的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二复合物的形成用带可检测标记的第二构象蛋白特异性结合试剂检测。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一构象蛋白特异性结合试剂与固体支持物偶联。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚集物通过将所述第一复合物接触异硫氰酸胍而从所述第一复合物脱离。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚集物通过将所述复合物接触高pH或低pH而从所述第一复合物脱离。11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚集物包括Aβ蛋白且所述构象蛋白特异性结合试剂是抗Aβ抗体。12.—种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含聚集物的样品与构象蛋白特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在聚集物结合形成复合物的条件下接触； 去除未结合样品； 将所述复合物与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂结合所述聚集物的条件下接触，其中所述试剂包括可检测标记；和 通过所述被疑存在聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述聚集物的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述构象蛋白特异性蛋白与固体支持物偶联。14.一种检测样品中聚集物存在的方法，所述方法包括步骤 提供含聚集物特异性结合试剂的固体支持物； 将所述固体支持物与带可检测标记的配体结合，其中所述聚集物特异性结合试剂与所述带可检测标记配体的结合亲合力弱于所述试剂与所述聚集物的结合亲合力； 将所述怀疑含聚集物的样品与所述固体支持物在允许所述聚集物存在于所述样品时能结合所述试剂并替代所述配体的条件下组合； 检测所述聚集物与所述聚集物特异性结合试剂间形成的复合物； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。15.一种减少多肽样品中聚集物量的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含聚集物的多肽样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在聚集物结合形成复合物的条件下接触；和回收未结合的多肽样品； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。16.一种区分样品中聚集物和单体的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含聚集物的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的聚集物结合形成复合物的条件下接触； 通过所述被疑存在的聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，区分所述聚集物和单体； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。17.一种评价对象患构象病可能性是否增加的方法，所述方法包括步骤 将来自怀疑患构象病对象的生物样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与被疑存在的致病性聚集物结合形成复合物的条件下接触； 通过被疑存在的所述致病性聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述致病性聚集物的存在； 如果所述生物样品中致病性聚集物含量高于没有构象病患者样品中的聚集物含量，确定所述对象患有构象病的可能性增加； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。18.—种评价构象病治疗有效性的方法，所述方法包括步骤 将接受构象病治疗患者的生物样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与被疑存在的致病性聚集物结合形成复合物的条件下接触； 通过所述被疑存在的致病性聚集物与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述致病性聚集物的存在； 如果所述生物样品中致病性聚集物含量低于对照中的致病性聚集物含量，确定所述治疗有效，其中所述对照是构象病治疗前所述患者生物样品中的致病性聚集物含量， 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约60nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约90nmol净电荷、或每平方米至少约120nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约500nmol净电荷、每平方米至少约IOOOnmol净电荷、每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物或致病性聚集物可溶。22.—种检测样品中寡聚体存在的方法，所述方法包括步骤 提供怀疑含寡聚体的样品，其中所述样品缺乏寡聚体外的聚集物； 将所述样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的寡聚体结合形成复合物的条件下接触； 通过所述被疑存在的寡聚体与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述寡聚体的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。23.一种检测样品中寡聚体存在的方法，所述方法包括步骤 提供怀疑含寡聚体的样品； 从所述样品中去除寡聚体之外的聚集物； 将所述样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在寡聚体结合形成复合物的条件下接触； 通过所述被疑存在的寡聚体与所述聚集物特异性结合试剂的结合，检测所述寡聚体的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述聚集物通过离心移出。25.一种检测样品中寡聚体存在的方法，所述方法包括步骤 将怀疑含寡聚体的样品与聚集物特异性结合试剂在允许所述试剂与所述被疑存在的寡聚体结合形成复合物的条件下接触； 将所述复合物与第二试剂接触，其中所述试剂优先结合寡聚体或寡聚体外的聚集物； 通过所述被疑存在的寡聚体与所述第二试剂的结合或不结合，检测所述寡聚体的存在； 其中所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+1的净电荷， 以每平方米至少约2000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物，和 附于所述固体支持物时对聚集物的结合优于对单体。26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡聚体外的聚集物包括原纤维。27.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡聚体可溶。28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述聚集物特异性试剂与所述聚集物或寡聚体间形成的所述复合物用去污剂处理的步骤。29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述处理步骤在所述接触步骤后进行。30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述去污剂是中性去污剂。31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述去污剂包括正和负电荷。32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述去污剂包括长碳链。33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述去污剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、η-十四烷基-N，N-二甲基-3-氨基-I-丙磺酸内酯、η-十六烷基-N，N-二甲基-3-氨基-I-丙磺酸内酯、η-十二烷基-N，N- 二甲基-3-氨基-I-丙磺酸内酯、氨基磺基甜菜碱-14，3-[Ν，Ν-二甲基(3-十四酰氨丙基)氨基]丙磺酸内酯、氨基磺基甜菜碱-16，3-[N, N-二甲基-N-(3-棕榈酰胺丙基)氨基]-丙-I-磺酸内酯、4-η-辛基苯甲酰氨-丙基-二甲氨基磺基甜菜碱和N，N- 二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。34.如权利要求1-33中任一项所述的方法,其特征在于,所述固体支持物选自硝酸纤维素、聚苯乙烯胶乳、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠、磁响应珠、氧化肽、二氧化硅、多糖珠、多糖膜、琼脂糖、玻璃、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇-聚苯乙烯杂合物、可控孔度玻璃、载玻片、金珠和纤维素。35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂被可检测标记。36.如权利要求1-14或16-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是包括身体组织或液体的生物样品。37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述生物样品包括全血、血液部分、血液组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、骨髓、尿液、泪液、乳液、淋巴液、器官组织、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、非神经系统组织、活检、尸检、脂肪活检、细胞、粪便、胎盘、脾组织、淋巴组织、胰腺组织、支气管肺泡灌洗液或滑液。38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述样品包括脑脊液(CSF)。39.如权利要求1-14或19-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品包括多肽。40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少约+2、至少约+3、至少约+4、至少约+5、至少约+6和至少约+7的净电荷。41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约3000nmol净电荷、每平方米至少约4000nmol净电荷、或每平方米至少约5000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。42.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂以每平方米至少约6000nmol净电荷、每平方米至少约7000nmol净电荷、每平方米至少约8000nmol净电荷、或每平方米至少约9000nmol净电荷的电荷密度附于固体支持物。43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂对聚集物的结合亲和性和/或亲合力比对单体的结合亲和性和/或亲合力至少高约2倍。44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个pKa比所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的pH高至少约IpH单位的带正电官能团。45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述至少一个带正电官能团在所述聚集物特异性结合试剂的所有官能团中最接近所述固体支持物。46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括疏水性官能团。47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述疏水性官能团是芳族疏水性官能团。48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述疏水性官能团是脂肪族疏水性官能团。49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括唯一的带正电官能团和至少一个疏水性官能团。50.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个带正电官能团和唯一的疏水性官能团。51.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括唯一的带正电官能团和唯一的疏水性官能团。52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个为L-异构体的氨基酸。53.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括至少一个为D-异构体的氨基酸。54.如权利要求1-16或19-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物为非致病性。55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述非致病性聚集物是酵母朊蛋白sup35或激素。56.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述非致病性聚集物是多肽的聚集物。57.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物为致病性。58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与先兆子痫、滔蛋白病变、TDP-43蛋白质病或丝氨酸病变相关的聚集物。59.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与淀粉样病相关的聚集物。60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述淀粉样病选自系统性淀粉样变性、AA淀粉样变性病、共核蛋白病、阿尔茨海默病、朊病毒病、ALS、免疫球蛋白相关疾病、血清淀粉样蛋白A相关疾病、亨廷顿氏病、帕金森病、II型糖尿病、透析相关性淀粉样变和脑淀粉样血管病。61.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与阿尔茨海默病相关的聚集物。62.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物是与脑淀粉样血管病相关的聚集物。63.如权利要求61或62所述的方法，其特征在于，所述与阿尔茨海默病或脑淀粉样血管病相关的聚集物包括β -淀粉样(Αβ )蛋白。64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述Aβ蛋白是A β 40。65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述Aβ蛋白是A β 42。66.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述与阿尔茨海默病相关的聚集物包括tau蛋白。67.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物包括糊精。68.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物包括淀粉样A蛋白。69.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述致病性聚集物包括α-突触核蛋白。70.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括在所述样品接触所述聚集物特异性结合试剂的PH下具有至少+1净电荷的至少一个氨基酸。71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述至少一个氨基酸在生理pH带正电。72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述至少一个氨基酸是选自赖氨酸和精氨酸的中性氨基酸。73.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述至少一个氨基酸是选自鸟氨酸、甲基赖氨酸、二氨基丁酸、高精氨酸和4-氨甲基苯丙氨酸的非天然氨基酸。74.如权利要求1-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括疏水性氨基酸。75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述疏水性氨基酸是芳族疏水性氨基酸。76.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述疏水性氨基酸是脂肪族疏水性氨基酸。77.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述疏水性氨基酸选自色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、高苯丙氨酸、苯甘氨酸、4-氯苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、噻吩丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、P-联苯丙氨酸、苯乙烯基丙氨酸、取代的苯丙氨酸、卤化苯丙氨酸、氨基异丁酸、丙烯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、I-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸和1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸。78.如权利要求1-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚集物特异性结合试剂包括选自 KKKFKF (SEQ ID NO : I)、KKKWKW (SEQ ID NO : 2)、KKKLKL (SEQ ID NO:3)、KKKKKK(SEQ ID NO :4)、KKKKKKKKKKKK(SEQ ID NO :5)、AAKKAA(SEQ ID NO :32)、AAKKKA(SEQ ID NO :33)、AKKKKA(SEQ ID NO:34)、AKKKKK(SEQ ID NO :35)、FKFKKK(SEQ IDNO 36)、kkkfkf (SEQ ID NO 37)、FKFSLFSG(SEQ ID NO 38)、DFKLNFKF(SEQ ID NO 39)、FKFNLFSG (SEQ ID NO 40)、YKYKKK (SEQ ID ...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·索尔兹伯里，D·佩列兹，A·杨，王雪梅，M·C·高，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：
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