用质谱技术进行ＨＰＶ定量的方法技术

本发明专利技术提供了一种分型和定量样品中的ＨＰＶ的新方法，其包括以下步骤：设计ＨＰＶ型别特异性突变质粒和野生质粒；构建数学模型以确定ＨＰＶ型别特异性突变质粒与野生型质粒的浓度比例与质谱峰图中相应的峰面积比值的相关性；对样品中的ＨＰＶ进行分型和定量。本发明专利技术还提供了用于该方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用质谱技术进行HPV定量的方法专利
本专利技术涉及人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)的检测方法，特别是 用质谱进行HPV分型和定量的新方法。专利技术背景人乳头瘤病毒(human papillomavirus，简称HPV)是一种小型、无包膜的DNA病 毒，其具有双链闭环的DNA基因组，大小约为7. 2-81Λ，相对分子量约为5X106。HPV基因组 可分为3个区域非编码的上游调节区；早期开放读码区，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5 ；晚期 开放读码区，编码主要衣壳蛋白Ll和小衣壳蛋白L2。根据编码主要衣壳蛋白Ll的开放读 码框(ORF)基因序列的不同，可以对HPV进行分型将Ll区ORF的相似性小于60%的HPV 分为不同的属，相似性在60-70%之间的HPV分为不同的种，相似性在71-89%之间的HPV 则分为不同的型别。目前已鉴定的HPV约有130多型，根据其病毒致病力大小，可分为高危 型 HPV，如 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 等，以及低危型 HPV，如 HPV6、HPVl 1、HPV42、HPV43、HPV44 等。 高危型HPV可致宫颈上皮内瘤病变(CN)，多见于高龄妇女，不易自然缓解，与宫颈癌的发生 关系密切。低危型HPV多见于年轻妇女，自然缓解率高。目前HPV检测技术主要包括第二代杂交捕获技术(HU)，荧光定量PCR、采用基质 辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)的质谱检测。其中HC2已成为 临床HPV检测领域的金标准。第二代杂交捕获技术(HC2)是美国Digene公司发展的、唯一获得FDA批准的可 在临床使用的一种检测HPV DNA的技术。该技术的原理是对抗体捕获信号进行放大和对 化学发光信号进行检测。该方法使用高危型和低危型核糖核酸探针，能检测13种高危型 HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59 和 68)，是一种易于操作的液基杂交检 测方法。然而，该方法并不能对HPV进行精确分型，也不能检测多重感染，并且当任何一种 型别的HPV DNA超过阈值时，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针还可与其他型别的 HPV(例如HPV 53、66、67和73)发生交叉反应，产生假阳性结果，降低实验特异性。荧光定量PCR(FQ-PCR)在常规PCR的基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为 一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结 果自动化分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。该方法通过探针杂交进 一步提高了 HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临 床工作和大规模筛查。然而，目前该方法主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV 亚型。同时，与HC2 —样，荧光定量PCR也不能实现对HPV进行精确分型，即不能明确HPV 感染型别。采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)的质谱检测 可以同时检测HPV型别的一种或几种，并能准确对HPV进行定量，其具有高灵敏度，高特异 性和高通量的特点，且相对于其它的检测方法成本低。然而，目前利用质谱技术定量HPV的 方法主要利用寡核苷酸(oligo)来对HPV DNA样品进行定量，由于oligo价格昂贵、设计复3杂且为一次性使用，因此，该方法在实际生产中的应用受到了很大的限制，无法满足大规模 测序和定量的生产需要。因此，迫切需要开发成本低，且能够实现HPV分型和定量检测的新方法，以适应我 国现有的大规模测序和定量的生产需要。
技术实现思路
本专利技术至少部分地基于下述原理根据待检测的HPV型别的碱基序列设计突变质 粒，该突变质粒含有HPV型别特异性DNA片段，并且该DNA片段与该HPV型别的野生型DNA 片段只相异于一个碱基；将该突变质粒作为竞争子与样品混合，并进行采用基质辅助激光 解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)的质谱检测法；根据获得的质谱峰图确定 HPV的型别，并利用质谱分析软件确定各个峰的峰面积数值，从而计算出样品中的HPV与竞 争子的浓度比；根据已知的竞争子的浓度，确定样品中HPV的含量，实现对样品中的HPV进 行定量的目的。本专利技术还至少部分地基于下述原理突变质粒与相应HPV型别的野生型DNA片段 只有一个碱基的差异，即，突变质粒与样品之间的差异尽可能小，因此，突变质粒与样品的 扩增效率基本上相同。基于此，利用质谱检测中的延伸产物峰的峰面积比值，可以根据竞争 子(突变质粒)的浓度来计算出样品中HPV的含量。因此，在一个方面，本专利技术提供了对样品中的HPV进行分型和定量的方法，其包括 以下步骤(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各HPV型别的野 生质粒分别包含第一 DNA片段，所述第一 DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增； 各HPV型别的突变质粒分别包含第二 DNA片段，所述第二 DNA片段与相同型别的野生质粒 的第一 DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获 得质谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质粒和突变质粒的浓度比与质谱峰图中各自的 延伸产物峰的峰面积比值的相关性；(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质 谱检测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤C3)之前，对待检测的样品进行稀释；(4)根据步骤C3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大小，从 而对样品中的HPV进行分型；(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质 粒的延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤( 获得的相关性确定样品中的HPV的浓度， 对样品中的HPV进行定量。在一个优选实施方案中，待检测的样品优选是宫颈脱落细胞。在一个优选实施 方案中，待分型和定量的 HPV 是 HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中的一种或几种。在一个实施方案中，本专利技术所使用的质谱检测法包括以下步骤1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增；3)以步骤1)或2)中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延 伸产物；4)任选地，纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和5)用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对步骤3)或4)的产物进行检 测。在一个优选实施方案中，本专利技术所使用的扩增引物的核苷酸序列分别如缺失5' 端前10个碱基的SEQ ID NO :1-21所示，优选所述扩增引物在5'端还包含标签序列，更优 选各扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于对样品中的ＨＰＶ进行分型和定量的方法，其包括以下步骤：（１）构建多个ＨＰＶ型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各ＨＰＶ型别的野生质粒分别包含第一ＤＮＡ片段，所述第一ＤＮＡ片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增；各ＨＰＶ型别的突变质粒分别包含第二ＤＮＡ片段，所述第二ＤＮＡ片段与相同型别的野生质粒的第一ＤＮＡ片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；（２）将不同浓度的各ＨＰＶ型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图，从而确定各个ＨＰＶ型别的野生质粒和突变质粒的浓度比与质谱峰图中各自的延伸产物峰的峰面积比值的相关性；（３）将待检测的样品与确定浓度的步骤（１）中构建的各突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤（３）之前，对待检测的样品进行稀释；（４）根据步骤（３）获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大小，从而对样品中的ＨＰＶ进行分型；（５）在确定样品中的ＨＰＶ型别后，测定样品的延伸产物峰与相应ＨＰＶ型别的突变质粒的延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤（２）获得的相关性确定样品中的ＨＰＶ的浓度，对样品中的ＨＰＶ进行定量；其中，优选所述样品是宫颈脱落细胞，优选待分型和定量的ＨＰＶ是ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６和ＨＰＶ６８中的一种或几种；其中，优选所述质谱检测法包括以下步骤：１）用扩增引物ＰＣＲ扩增ＤＮＡ，从而获得扩增产物；２）任选地，除去步骤１）的扩增产物中的ｄＮＴＰ，优选通过使用ＳＡＰ酶处理所述扩增产物来除去ｄＮＴＰ；３）以步骤１）或２）中获得的产物为模板，用延伸引物通过单碱基延伸反应获得延伸产物；４）任选地，纯化所述延伸产物，优选通过树脂来进行纯化，从而获得纯化产物；和５）用基质辅助激光解吸附／电离飞行时间质谱系统对步骤３）或４）的产物进行检测；进一步优选，所述扩增引物的核苷酸序列分别如缺失５′端前１０个碱基的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１－２１所示，优选所述扩增引物在５′端还包含标签序列，更优选各扩增引物的核苷酸序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１－２１所示；优选所述延伸引物的核苷酸序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２－３６所示；优选各ＨＰＶ型别的突变质粒的所述延伸碱基分别如表２所示。...

【技术特征摘要】
1.用于对样品中的HPV进行分型和定量的方法，其包括以下步骤(1)构建多个HPV型别的每一个型别的野生质粒和突变质粒，其中各HPV型别的野生 质粒分别包含第一DNA片段，所述第一 DNA片段能够用于进行针对该型别的特异性扩增；各 HPV型别的突变质粒分别包含第二 DNA片段，所述第二 DNA片段与相同型别的野生质粒的第 一 DNA片段仅在延伸碱基所对应的位点上相异；(2)将不同浓度的各HPV型别的野生质粒与突变质粒混合，并进行质谱检测法，获得质 谱峰图，从而确定各个HPV型别的野生质粒和突变质粒的浓度比与质谱峰图中各自的延伸 产物峰的峰面积比值的相关性；(3)将待检测的样品与确定浓度的步骤(1)中构建的各突变质粒混合，并进行质谱检 测法，获得质谱峰图；任选地，在进行步骤C3)之前，对待检测的样品进行稀释；(4)根据步骤C3)获得的质谱峰图确定所述样品的延伸产物峰的分子量大小，从而对 样品中的HPV进行分型；(5)在确定样品中的HPV型别后，测定样品的延伸产物峰与相应HPV型别的突变质粒的 延伸产物峰的峰面积比值，从而根据步骤( 获得的相关性确定样品中的HPV的浓度，对样 品中的HPV进行定量；其中，优选所述样品是宫颈脱落细胞，优选待分型和定量的HPV是HPV6、HPV11、HPV16、 HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66 和 HPV68 中 的一种或几种；其中，优选所述质谱检测法包括以下步骤1)用扩增引物PCR扩增DNA，从而获得扩增产物；2)任选地，除去步骤1)的扩增产物中的dNTP，优选通过使用SAP酶处理所述扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩颖鑫，韦清，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]