本发明专利技术公开了一种单个核细胞人白细胞抗原Ａ或Ｂ检测移植病人免疫状态的方法，取脏器移植病人外周血，分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总模板核糖核酸，对外周血淋巴细胞总模板核糖核酸进行鉴定，对人白细胞抗原Ａ或人白细胞抗原Ｂ特异性引物进行筛选，然后进行一步法一管扩增体系，以上、下游引物作为内参照，然后对扩增产物进行电泳扫描及序列分析，最后采用与上述引物相对应的荧光探针检测人白细胞抗原Ａ或人白细胞抗原Ｂ抗原表达强度的高低。它可以通过检测脏器移植病人的外周血单个核细胞人白细胞抗原Ａ或Ｂ的抗原表达强度，以达到根据该强度的高低，确定病人用药量，以此提高脏器移植的成功率及病人的身体健康状况等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学、免疫学检测方法，特别涉及单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法。
技术介绍
随着医学领域科学技术的进步，能够移植的脏器不断增加，随之进行脏器移植的病人越来越多。脏器移植病人的免疫状态决定移植的成功与否及合并症是否发生，当病人出现排斥反应时应能及时处理，否则易导致移植失败，药物用量过小不能达到控制排斥反应的目的，如果药物用量过大，则易使免疫抑制过度，细菌病毒感染，肿瘤发生。而目前尚未有能够准确检测脏器移植病人免疫状态的任何方法，因此，脏器移植的病人所有抗免疫抗排斥的用药量，均是根据估值或经验确定，无法根据病人的自身情况准确确定用药量。在目前这种状态下，直接影响脏器移植的成功率、移植后病人的寿命及病人身体的健康状况等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，它可以通过检测脏器移植病人的外周血单个核细胞人白细胞抗原A或B的信使核糖核酸表达强度，以达到根据该强度的高低，确定病人用药量，以此提高脏器移植的成功率及病人的身体健康状况等。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案来实现单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，取脏器移植病人外周血，分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总模板核糖核酸，对外周血淋巴细胞总模板核糖核酸进行鉴定，对人白细胞抗原A或人白细胞抗原B特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-CTACCCTGCGGAGATCAC-3’，下游引物5’-AGAGAACCAGGCCAGCAAT-3’，或人白细胞抗原B的上游引物5’-CACACTGACCTGGCAGCGGGAT-3’；下游引物5’-AGAGCCCTGGGCACTGTCGCT-3’，进行一步法—管扩增体系，以β-肌动蛋白作为内参照，其上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，反应体系20-30ul，其中逆转录酶0.2-1.5ul，耐热扩增酶0.1-0.4ul，脱氧核苷酸0.1-0.5ul，氯化镁1-4ul，缓冲液1-6ul，余量是去核糖核酸酶的双蒸水，目的片段人白细胞抗原A的上下游引物或人白细胞抗原B的上下游引物各0.4-2ul，以β-肌动蛋白作为内参照，上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’各0.1-1ul，模板核糖核酸4-20ul，多聚酶链反应仪反应参数为40-42℃ 20-40min，90-96℃ 2-5min，90-96℃ 0.5-3min，52-60℃ 0.5-3min，70-75℃ 0.5-3min，3-10个循环；90-96℃ 5-30sec，60-65℃ 10-60sec，30-45个循环，70-75℃ 3-15min，然后对扩增产物进行电泳扫描及序列分析，最后采用与上述引物相对应的荧光探针检测人白细胞抗原A或人白细胞抗原B信使核糖核酸表达强度的高低。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，其一步法—管扩增体系中各参数可以是，以β-肌动蛋白作为内参照，其上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’、下游引物5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，反应体系25ul，其中逆转录酶1ul、耐热扩增酶0.2ul，脱氧核苷酸0.2ul，氯化镁2.5ul，缓冲液2.5ul，其余是去核糖核酸酶的双蒸水，多聚酶链反应仪反应参数为42℃ 30min，95℃ 3min，94℃ 1min，57℃1min，72℃ 1min，5个循环；94℃ 10sec，62℃ 30sec，33个循环，72℃ 5min。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-AGAACCAGGCCAGCAATG-3’。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-GGAGAGGAGCAGAGATACAC-3’，下游引物5’-ACCAGGCCAGCAATGATG-3’。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-TGGAGAGGAGCAGAGATACACC-3’，下游引物5’-TCACGGCAGCGACCACAG-3’。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原A的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原A的上游引物5’-CCCATCTCTGACCATGAG-3’，下游引物5’-GGTGTATCTCTGCTCCTC-3’。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出入白细胞抗原B的上游引物5’-GGGCAGCTGTGGTGCCT-3’，下游引物5’-CACTGTCGCTGCACGCAGCCT-3’。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-CTGCCGAAGCCCCTCACCCTCT-3’，下游引物5’-AGGACCAGACCCAGGACA-3’。所述的单个核细胞人白细胞抗原A或B检测移植病人免疫状态的方法，对人白细胞抗原B的特异性引物进行筛选得出人白细胞抗原B的上游引物5’-GCCGTCTTCCCAGTCCACCGT-3’，下游引物5’-ATGCCCACGATGGGGACGGT-3’。本专利技术的积极效果在于为脏器移植病人免疫状态的强弱提供了一种准确的检测方法，使医生可以根据脏器移植病人自身的免疫状态确定抗排斥的药量，从而避免了因用药量过大或过小产生的移植失败、细菌病毒感染、肿瘤发生等严重后果。采用本专利技术的检测方法，能够准确掌握脏器移植病人免疫状态的强弱，提高脏器移植成功率及病人的身体健康状况。具体实施例方式本专利技术的检测方法如下首先取外周血淋巴细胞(PBL)进行分离无菌抽取移植病人外周血2ml，EDTA-K2防凝。3000rpm/min离心10min(普通离心机)，4小时内完成。以无菌吸管仔细吸取白细胞层，稀释后缓慢加入盛有2ml淋巴细胞分离液的无菌管中，3000rpm/min离心25min(普通离心机)。以无菌吸管小心吸取单个核细胞至一灭菌Ependoff管中，5000rpm/min离心4min(普通离心机)吸弃上清液(-80℃可长期保存)。对淋巴细胞总模板核糖核酸(RNA)进行提取，(以下均为冰上操作，所有器材预先用去核糖核酸酶的双蒸水处理)取出冻存的淋巴细胞加入50ulTE溶解沉淀，然后加入150ul白细胞裂解液(深圳匹基生物公司生产)，反复吹打至细胞完全裂解。在裂解的细胞混合液中加入50ul氯仿抽提RNA，冰浴5-7min，15000rpm/min离心10min(高速冷冻离心机)。离心后可见混合液分为三层，吸取最上层无色水相，加入等本文档来自技高网...
【技术保护点】
单个核细胞人白细胞抗原Ａ或Ｂ检测移植病人免疫状态的方法，取脏器移植病人外周血，分离淋巴细胞，提取淋巴细胞总模板核糖核酸，对外周血淋巴细胞总模板核糖核酸进行鉴定，其特征在于：对人白细胞抗原Ａ或人白细胞抗原Ｂ特异性引物进行筛选得出：人白细胞抗原Ａ的上游引物５’－ＣＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣ－３’，下游引物５’－ＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＴ－３’，或人白细胞抗原Ｂ的上游引物５’－ＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＡＴ－３’；下游引物５’－ＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＴＣＧＣＴ－３’，然后进行一步法一管扩增体系，以β－肌动蛋白作为内参照，其上游引物５’－ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ－３’、下游引物５’－ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ－３’，反应体系２０－３０ｕｌ，其中逆转录酶０．２－１．５ｕｌ，耐热扩增酶０．１－０．４ｕｌ，脱氧核苷酸０．１－０．５ｕｌ，氯化镁１－４ｕｌ，缓冲液１－６ｕｌ，余量是去核糖核酸酶的双蒸水，目的片段人白细胞抗原Ａ的上下游引物或人白细胞抗原Ｂ的上下游引物各０．４－２ｕｌ，内参照上游引物５’－ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ－３’、下游引物５’－ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ－３’各０１．－１ｕｌ，模板核糖核酸４－２０ｕｌ，多聚酶链反应仪反应参数为４０－４２℃２０－４０ｍｉｎ，９０ －９６℃２－５ｍｉｎ，９０－９６℃０．５－３ｍｉｎ，５２－６０℃０．５－３ｍｉｎ，７０－７５℃０．５－３ｍｉｎ，３－１０个循环；９０－９６℃５－３０ｓｅｃ，６０－６５℃１０－６０ｓｅｃ，３０－４５个循环，７０－７５℃ ３－１５ｍｉｎ，然后对扩增产物进行电泳扫描及序列分析，最后采用与上述引物相对应的荧光探针检测人白细胞抗原Ａ或人白细胞抗原Ｂ信使核糖核酸表达强度的高低。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹雄，张义，杨晓静，秦绪珍，庄学伟，单宁宁，王洪春，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。