【技术实现步骤摘要】
人类白细胞抗原HLA-A、B基因全长序列测定以及HLA基因测序分型方法
本专利技术涉及生物医学及免疫遗传学，特别是涉及组织配型相关基因HLA-A、-B的 全长序列测定以及HLA基因测序分型方法。
技术介绍
人类白细胞抗原HLA(Human Leukocyte Antigen)分子提呈抗原肽给T淋巴细胞 识别，在适应性免疫应答中起着极其重要的作用。HLA基因同时又是人类重要的遗传结构， 在法医鉴定、器官移植配型等领域应用广泛。众所周知，高度的多态性是HLA基因一个非常重要的特点。以往对人类白抗原基 因多态性的研究主要是针对编码抗原结合肽的外显子(HLA-A、-B基因的第2-4外显子， HLA-DQBU -DRBl基因的第2外显子)。众多研究者对这些外显子的分型技术、多态位点的 探测、疾病相关性以及进化分析研究做了大量工作。然而，越来越多的研究表明，HLA基因非编码区的多态位点及其功能也不容忽视。 上世纪90年代，科学家们开始投入到对HLA基因的调控区特别是5’ -启动子的多态性研 究当中，并从进化、功能分析等多种角度揭示了这些位于调控区的SNPs在基因表达调控中 的...
【技术保护点】
一种人类白细胞抗原ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ基因全长序列测定方法，其特征在于，该方法包括： ａ、各由一对位点特异性ＰＣＲ扩增引物对ＨＬＡ－Ａ基因的４．３ｋｂ全长序列，ＨＬＡ－Ｂ基因的３．７ｋｂ全长序列进行ＰＣＲ扩增，扩增采用高保真的聚合酶（Ｐｆｕｕｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ），扩增区域包含两个基因的５’－启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及３’－ＵＴＲ序列； ｂ、将ＨＬＡ－Ａ ４．３ｋｂ扩增产物以及ＨＬＡ－Ｂ ３．７ｋｂ扩增产物进行末端加碱基’Ａ’反应并克隆至ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体当中，挑选阳性克隆、提取质粒、分别通过载体两端引物以及正...
【技术特征摘要】
一种人类白细胞抗原HLA A、 B基因全长序列测定方法，其特征在于，该方法包括a、各由一对位点特异性PCR扩增引物对HLA A基因的4.3kb全长序列，HLA B基因的3.7kb全长序列进行PCR扩增，扩增采用高保真的聚合酶(Pfuultra II Fusion HS DNA polymerase)，扩增区域包含两个基因的5’ 启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及3’ UTR序列；b、将HLA A 4.3kb扩增产物以及HLA B 3.7kb扩增产物进行末端加碱基‘A’反应并克隆至pGEM Teasy载体当中，挑选阳性克隆、提取质粒、分别通过载体两端引物以及正、反双向十条保守步移测序引物将两个基因的全长序列测通，共获得中国汉族个体HLA A 38种等位基因的4.3kb全长序列，HLA B 30种等位基因的3.7kb全长序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，扩增HLA-A4. 3kb全长 序列的PCR引物包括上游引物A-genome-F和下游引物A-genome-R，其中，上游引物 A-genome-F 的序列为5 ' -ACTCAGAGCTAWGGAATGATG-3 '，下游引物 A-genome-R 的序 列为5' -ACC 5 ‘ -ATGGAGCAGCAAAGATGAC-3 ‘；扩增 HLA-B 3. 7kb 全长序列的 PCR 引物包括上游引物B-genome-F和下游引物B-genome-R,其中，上游引物B-genome-F 的序列为5 ‘ -CCAGTTCARGGACAGGGATTC-3 ‘，下游引物 B-genome-R 的序列为 5' -AACAGACTCAGCACAGCRAAC-3‘。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HLA-A4. 3kb全长序列的PCR扩增引 物以及HLA-B 3. 7kb全长序列的扩增引物，扩增区域包含两个基因的5’-启动子序列，所有 外显子，所有内含子，以及3’ -UTR序列；上游扩增引物A-Genome-F及B-Genome-F分别位 于HLA-A、-B基因的5’ -启动子上游，下游扩增引物A-Genome-R及B-Genome-R分别位于 HLA-A、-B基因的3’ -UTR下游，将有多态性的碱基设计为简并碱基，可同时扩增HLA-A、-B 基因所有不同子系的等位基因全长序列。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述测序引物除载体两端通用 测序引物(T7、SP6)外，包括的HLA-A基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为ntl)如下A--Genome--SFl5'-CCCAGGCGTGGCTCTCAG--3'，NT-266 ‘ NT-249A--Genome--SF25'-CTACTACAACCAGAGCGA--3'，NT451 ^NT468 ；A--Genome--SF35'-CCTCCCTCTGGTCCTGAG--3'，NT1091 ‘ NT1108A--Genome--SF45'-CCAGACCCAGGACACGGA--3'，NT1691 ‘ NT1708A--Genome--SF55'-AGCAGTCACAAGTCACAG--3'，NT2288 ‘ NT2305A--Genome--SRl5'-TAAACAGCCCATCGCATG--3'，NT2840 ‘ NT2823A--Genome--SR25'-AGGTGCTTTACAAAAGAG--3'，NT2230 ‘ NT2213A--Genome--SR35'-GCCAGGTCAGTGTGATCT--3'，NT1674 ‘ NT1657A--Genome--SR45'-AATTGTCTCCCCTCCTTG--3'，NT1068 ‘ NT1051A--Genome--SR55'-GKCCTCGCTCTGGTTGTA--3'，NT472 一NT455 ；HLA-B基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下 B-Genome-SFl :5’ -GCCCTGACCGAGACCTG-3’，NT52 NT68 ； B-Genome-SF2 :5，-CGGTTTCATTTTCAGTTG-3，，NT625 NT642 ； B-Genome-SF3 :5’ -CCCTCTTCTCTCTAGGAC-3，，NT1146 NT1163 ；B--Genome--SF4:5，-CAGACCAGCAGGAGATAG--3'',NTmO ‘ NT1737B--Genome--SF5:5，-ATGAGTCAGGGGAAGGTC--3'‘，NT2296 ‘ NT2313B--Genome--SRl:5，-GGATTTTGGCCTCAACTG--3'‘，NT2711 ‘ NT2694B--Genome--SR2:5，-GGACTGTCTTCCCCTCCA--3'‘，NT2209 ‘ NT2192B--Genome--SR3:5，-TGGTCTGGTCTCCACAAG--3'‘，NT1726 ‘ NT1709B--Genome--SR4:5，-GTGCTGGCACACAGGGTC--3'NT1208 ‘ NT1191B--Genome--SR5:5，-AGACCCCAAGAATCTCAC--3'‘，NT654 一NT637。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述38种HLA-A等位基因完 整的4. 3kb基因组全长序列，序列从基因的5，-启动子上游nt-819至3，_UTR下游nt3435 处，全部延伸了国际IMGT/HLA数据库中释放的该基因最长序列NT-300 NT3203，其中新等 位基因全长序列7个，将已有等位基因的编码区、5’-启动子区、3’-非翻译区及所有内含子 序列补充完整的等位基因31个；所述30个HLA-B等位基因完整的3. 7kb基因组全长序列， 序列从基因的5，-启动子上游nt-410至3，-UTR下游nt3298处，全部延伸了国际IMGT/ HLA数据库中释放的该基因最长序列NT-284 NT3039，其中新等位基因全长序列3个，将 已有等位基因的编码区、5’ -启动子区、3’ -非翻译区及所有内含子序列补充完整的等位基 因27个。6.如权利要求1至5中任一条所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B全长序列PCR 扩增反应体系为IOXPfu Buffer 2. 5 μ L dNTP(25mM)2.0 μ LPCR 引物(10 μ Μ) 各 IyL 基因组DNAIOOngPfu 酶(5U/ μ L)0· 5 μ L力口 ddH20 至25 μ L。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，HLA-A、-B全长序列扩增反应体系中，其循环 参数为95 0C 2min95 °C 30Sec58 °C 30Sec72 °C 3min，35 个循环72 °C 15min4 °C Infinite。8.—种HLA基因测序分型方法，其特征在于，该方法包括 a、HLA-A、-B的测序分型方法为将HLA-A、-B均分别由两对位点特异性PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其 中，第一对PCR引物的扩增产物涵盖第1外显子至第4外显子，第二对PCR引物的扩增产物 第5外显子至第8外显子；两个基因分别通过十四条正向和反向测序引物对扩增产物进行 测序反应，其中，分别对HLA-A、-B基因的第1、2、3、4、5、6、以及7外显子进行正、反向双向 测序；b、HLA-DRB1、-DQBl的测序分型方法为采用八条5’端等位基因组特异性引物分别与一条3’端通用位点特异性引物扩增DRBl 的第2外显子至第3外显子的序列，DRBl的第2外显子采用八条5’端等位基因组特异性 引物与一条3’端位点特异性通用测序引物进行正、反双向测序，DRBl的第3外显子采用一 对位点特异性通用测序引物进行正、反双向测序，采用一条5’端通用位点特异性引物分别 与三条3’端等位基因组特异性引物对DQBl第2外显子进行PCR扩增，一对位点特异性引 物对第3外显子进行PCR扩增，通过4条测序引物分别对第2外显子扩增产物和第3外显 子扩增产物进行正、反双向测序。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，扩增HLA-A第1至4外显子的 PCR引物包括上游引物A-SBT-Fl和下游引物A-SBT-R1，其中，上游引物A-SBT-Fl的序列 及核苷酸位置为5 ‘ -GAGAAGCCAATCAGTGTCKTC-3 ‘ (nt-84 nt_64)，下游引物 A-SBT-Rl 的序列及核苷酸位置为5，-GCTTTCCSTAARAGACATGAC-3‘ (ntl866 ntl886)；扩增 HLA-A 第5至8外显子的PCR引物包括上游引物A-SBT-F2和下游引物A-SBT-R2，其中，上游引物 A-SBT-F2 的序列及核苷酸位置为5，-AAGGAGGGAGAYGGGGGTGTC-3，(NT 1848 NT1868)， 下游引物 A-SBT-R2 的序列核苷酸位置为5 ‘ -TGCCTYTCAGTCCCACACAAG-3 ‘ (nt2913 nt2933)，扩增HLA-B第1至4外显子的PCR引物包括上游引物B-SBT-Fl和下游引物 B-SBT-Rl，其中，上游引物B-SBT-Fl的序列及核苷酸位置为5 ‘ -CTAGAGAAGCCAATCAGYGTC -3' (NT-86 NT-66)，下游引物B-SBT-Rl的序列及核苷酸位置为5' -CCCGCCCTGAGMSAGA TATG-3' (NT1865-NT1881，5，端加CCCG)；扩增HLA-B第5至8外显子的PCR引物包括上游 引物B-SBT-F2和下游引物B-SBT-R2，其中，上游引物B-SBT-F2的序列及核苷酸位置为5， -AGGGGGATGAGGGGTCATATC-3，(NT 1849 NT1869)，下游引物 B-SBT-R2 的序列及核苷酸位置 为5’ -AGACACATTCAGGTGCCTTTG-3’ (NT2953 NT2973)。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述HLA-A、-B基因的第1至第4外显子 的PCR扩增引物的上游引物A-SBT-Fl及B-SBT-Fl分别位于HLA_A、_B基因的5’ -启动子 区域，下游引物A-SBT-Rl及B-SBT-Rl分别位于HLA-A、-B基因的第4内含子区域，扩增区 域涵盖了两个基因分型常规检测区域第2、3、4外显子，还包含了部分5’-启动子区、第1外 显子、第1内含子、第2内含子、第3内含子以及部分第4内含子序列，HLA-A、-B基因第1 至第4外显子的PCR扩增引物的扩增片断长约为1970bp ；所述HLA-A、-B基因的第5至第 8外显子的PCR扩增引物的上游引物A-SBT-F2及B-SBT-F2分别位于HLA_A、_B基因的第4 内含子区域，下游引物A-SBT-R2及B-SBT-R2分别位于HLA-A、-B基因的3，-UTR区，扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐筱娉，邓志辉，王大明，高素青，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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