14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法技术

本发明专利技术基于KIR基因组全长序列的结构特点、SNPs多态性分布以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，设计具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物56对。每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对特异性PCR引物进行扩增；纯化后的PCR扩增产物，采用特异性正向、反向测序引物对每一外显子进行双向测序反应。设计使用的测序引物共计230条。本发明专利技术首次建立了适合于高通量化KIR测序分型的方法，全部的14个功能性KIR基因可在同一PCR扩d增条件下进行同步扩增，并且所需时间短；测序分型涵盖了每个功能性KIR基因的全部编码区；所获得的序列无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。在群体遗传学、疾病关联、骨髓移植等领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法
本专利技术涉及生物医学，特别是DNA测序分型领域。本专利技术提供一种适合于高通量化的全部14个功能性KIRs基因同步扩增、同步测序分型的方法。
技术介绍
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killerimmunoglobulin-likereceptors,KIRs)属于免疫球蛋白超家族，表达于自然杀伤细胞(NK细胞)和部分T细胞表面。按胞外结构域的数量，可分为KIR2D及KIR3D亚家族；根据胞浆区长短和免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)的有无，KIR功能上分为抑制型(L型)和激活型(S型)。KIR分子与靶细胞表面HLAⅠ类抗原结合，传导激活或抑制信号，调节NK细胞的活性，在移植免疫、肿瘤免疫和机体抗感染中均发挥重要作用。KIR基因家族位于人类第19号染色体上，呈共显性表达，除两个假基因2DP1和3DP1外，还包括14种功能性KIR基因(KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3、3DS1)[1]。KIR基因结构复杂：功能性KIR3D基因中除了KIR3DL3缺失第6外显子外，其余的功能性KIR3D基因(3DL1、3DL2、3DS1)均含有9个外显子、8个内含子以及5’-启动子区和3’-UTR区。各个外显子分别编码不同的肽结构域，其中第1外显子和第2外显子编码引导肽，第3外显子、第4外显子、第5外显子分别编码胞外区的D0、D1、D2结构域，第6外显子编码茎部结构域，第7外显子编码跨膜区，第8外显子和第9外显子编码胞浆区；KIR2D基因中，KIR2DS1～3、2DS1～5等8个基因的第3外显子为假外显子(pseudoexon)，不能编码相应的D0胞外结构域；KIR2DL4、2DL5均缺失第4外显子，无D1胞外结构域。在国际IPD-KIR数据库[2](http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/kir/)中，被收录的KIR基因组序列全长为9901～17009bp。每个功能性KIR基因的编码区序列(codingsequence,CDS)全长仅915～1368bp(见表3)，而非编码区序列长达8773～15641bp(见表4)，非编码区序列中位于第6外显子两翼的第5内含子及第6内含子序列长度占相应的KIR基因组全长序列的44.0％～61.2％(见表4)。功能性KIR基因的第1外显子(长度为34或40bp)和第2外显子(长度均为36bp)，长度短，SNPs多态性有限：2DL2、2DL4及2DS4基因第1、第2外显子无SNPs多态性，其余的存在1～3个SNPs位点。介于第1外显子、第2外显子之间的第1内含子，长度为199～2280bp。由于第1、第2外显子长度短、SNPs多态性有限，常规测序分型时并非每个KIR基因均需要检测；必要检测时宜进行PCR单独扩增，并且PCR扩增产物涵盖完整的第1外显子、第1内含子和第2外显子不会导致扩增产物片段过长。第3、第4和第5外显子，每个外显子的长度相对较长(282～300bp)，SNPs多态性丰富，应对编码胞外结构域的外显子及外显子之间的内含子进行单独PCR扩增。鉴于KIR2DL1～3及KIR2DS1～5共8个基因的第3外显子为假性外显子，无需检测，扩增产物涵盖完整的第4外显子、第4内含子及第5外显子，对第4、第5外显子进行双向测序；KIR2DL4和2DL5无第4外显子，扩增产物涵盖完整的第3外显子、第5外显子以及介于其间的内含子序列，对第3、第5外显子进行双向测序；其余4个功能性KIR基因(KIR3DS1、3DL1～3)，扩增产物涵盖完整的第3外显子、第4外显子、第5外显子及介于其间的内含子序列，对第3、第4和第5外显子进行双向测序。第6外显子(KIR3DL3缺失该外显子)，长度仅51bp，基于的IPD-KIRDatabase(Release2.6.0)，4个KIR基因(2DS4、3DL1、3DL2及3DS1)的第6外显子无SNPs位点，其余的功能性KIR基因有1～2个SNPs位点。由于第6外显子SNPs多态性分布有限，并且位于第6外显子两翼的第5、第6内含子序列长达4937～9841bp(见表4)，因此检测第6外显子的多态性，须对第6外显子进行PCR单独扩增，以免因扩增完整的第5内含子和/或第6内含子的序列而导致扩增产物片段过长、扩增时间过长并影响扩增效率。第7、第8、第9外显子的长度分别为102～105bp、51～53bp、8～270bp；第7、第8内含子长度分别为460～462bp、98～118bp。因此，扩增完整的第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子序列，不会导致扩增产物片段过长。基于上述全部功能性KIR基因的基因组全长序列的结构、SNPs多态性分布以及外显子两翼内含子的长度等特征，对于制定科学、高效的PCR扩增策略至关重要。KIR基因的多态性，体现在KIR等位基因多态性及单倍体组成上。截止2017年4月，国际IPD-KIRDatabase(Release2.6.0)公布的功能性KIR等位基因总数已达698个，其中不表达KIR等位基因7个；在14个功能性KIR基因中，多态性最为丰富的KIR3DL2具有112个等位基因(表5)。鉴定KIR等位基因具有功能性意义。不同的KIR基因表达水平不同，McErlean等[3]发现不同的KIR基因mRNA表达水平由高到低依次为：KIR3DL2>KIR2DS2>KIR3DS1>KIR2DS5>KIR2DL5>KIR2DS3>KIR2DL1>KIR3DL1>KIR2DS1>KIR2DL2>KIR2DL4>KIR2DS4>KIR2DL3。同一KIR基因中不同的等位基因其表达水平、亲和力及介导的激活/抑制能力也存在差异。Yawata等[4]报道KIR3DL1等位基因在NK细胞膜上表达水平由高到低依次为：KIR3DL1*01502>*020>*001>*007>*005，介导的抑制性作用强弱依次为：KIR3DL1*001>*005>*01502>*020>*007；KIR3DL1*005在细胞表面表达水平低，但介导的抑制能力较强。高加索人群中最常见的KIR3DL1*004等位基因，不表达于细胞表面[5]。KIR2DS4*003、*004、*006、*007、*008、*009、*010、*012和*013在第5外显子CDSnt454～nt475位置存在22bp的缺失，引起阅读框移位，编码截短的多肽不能正常表达于细胞表面[6]。鉴于不同的KIR基因表达水平不同，同一KIR基因中不同的等位基因其表达水平、介导的激活/抑制能力也存在差异，鉴定和甄别常见型无激活/抑制效应的KIR等位基因十分必要。研究和建立高通量、高分辨水平的KIR基因同步测序分型的方法，在等位基因水平的基础上开展KIR应用研究尤为迫切。当前，普遍采用的序列特异性引物-聚合酶链反应(sequencespecificprimer-polymerasechainre本文档来自技高网...

【技术保护点】
14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法，其特征在于，根据各KIR基因的基因组全长序列的结构、编码区单核苷酸多态性分布特点以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物进行PCR同步扩增；针对纯化后的PCR扩增产物所含的每一外显子，分别进行正向、反向双向测序，如图1所示。

【技术特征摘要】
1.14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法，其特征在于，根据各KIR基因的基因组全长序列的结构、编码区单核苷酸多态性分布特点以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物进行PCR同步扩增；针对纯化后的PCR扩增产物所含的每一外显子，分别进行正向、反向双向测序，如图1所示。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述KIR基因特异性PCR扩增引物，除了KIR3DL3因缺失第6外显子仅用3对PCR引物、KIR2DL1采用5对PCR引物外，其余的每个功能性KIR基因均采用4对PCR引物；PCR引物共56对，计112条；每条PCR引物的序列、在KIR基因组全长序列中的位置，以及扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓志辉，甄建新，张国彬，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：广东,44