一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定的相关引物、试剂盒、方法技术

本发明专利技术公开了一种人类白细胞抗原HLA‑E、‑F、‑G基因全长序列测定相关的引物、试剂盒、方法。采用本发明专利技术的引物、方法对HLA‑E、‑F、‑G全基因进行扩增，条带清晰，扩增特异，测序结果峰图质量良好。步移引物测得的序列拼接后可得到HLA‑E、‑F、‑G全基因序列及分型结果。

A primer, kit and method for sequencing HLA-E, - F, - G Genes

【技术实现步骤摘要】
一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定的相关引物、试剂盒、方法
本专利技术涉及生物医学及免疫遗传学，特别是涉及一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定相关的引物、试剂盒、方法。
技术介绍
人类白细胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA)分子提呈抗原肽给T淋巴细胞识别,在适应性免疫应答中起着极其重要的作用。HLA基因同时又是人类重要的遗传结构，在法医鉴定、器官移植配型等领域应用广泛。HLA系统分为3类：HLA-I、HLA-II及HLA-III类。HLA-I类基因又根据编码产物的组织分布，功能及多态性不同可分为经典MHC-I类(HLA-Ia)和非经典MHC-I类(HLA-Ib)基因。HLA-E、-F、-G基因都属于HLA-Ib类，它们在结构上十分相似，与HLA-Ia基因相比，HLA-E、-F、-G基因多态性及其有限，其抗原结构、表达、功能等也与HLA-Ia有较大差异。众所周知，高度的多态性是HLA基因一个非常重要的特点。以往对人类白抗原基因多态性的研究主要是针对编码抗原结合肽的外显子。众多研究者对这些外显子的分型技术、多态位点的探测、疾病相关性以及进化分析研究做了大量工作。然而，越来越多的研究表明，HLA基因非编码区的多态位点及其功能也不容忽视。上世纪90年代，科学家们开始投入到对HLA基因的调控区特别是5’-启动子的多态性研究当中，并从进化、功能分析等多种角度揭示了这些位于调控区的SNPs在基因表达调控中的作用。大量研究表明，HLA基因调控区多态性蕴含了丰富的与基因进化、基因表达调控以及疾病相关联的信息。非编码区中除了调控区，内含子多态性也相当可观，它们对于测序分型试剂盒的开发及完善非常重要。HLA基因测序分型的PCR引物和测序引物，通常位于目的外显子的侧翼即调控区及内含子内。某些等位基因的调控区及内含子中存在未知的变异，可能刚好位于现有分型试剂盒的引物结合位点，导致分型时对该等位基因漏检和丢失现象(Alleledropout)。因此要开发一种长久行之有效的分型试剂盒必须要掌握尽可能丰富的非编码区多态信息。目前，HLA-E、-F、-G是人类白细胞抗原系统中被IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)公布的等位基因数目最少的功能基因。原因之一是其外显子多态性本身较其它经典的HLA-I类分子少，另一原因是非经典的HLA-I类分子在之前受关注较少，对其多态性的研究较为有限，基因分型也只是针对部分编码抗原肽结合槽的外显子进行，如针对HLA-E多态性研究较多的是区分HLA-E*01:01与HLA-E*01:03的第3外显子。我们前期对中国汉族群体经典的HLA-I类基因全长序列多态性研究发现，除了编码抗原肽结合区的外显子(HLA-I类第2-4外显子)具有丰富的单核苷酸多态性(SNPs)外,HLA基因全长其它区域包括外显子1、5、6、7，5’-启动子、3’-UTR甚至内含子区都具有高度的多态性。HLA-I类基因表达调控起关键作用的EnhancerA、ISRE(Interferin-stimulatedresponseelement)、Siteα、EhancerB等调控元件，以丛集的方式存在于基因起始密码子的上游300bp以内(即5’-启动子的NT-300～NT-1)，协同进行转录活性的调控。IMGT/HLA数据库中公布的HLA基因全长数据包含了300bp调控功能比较清晰的近端启动子。近年来，HLA-I类基因3’-UTR的调控功能陆续报道，3’-UTR作为其靶标序列在基因表达调控中的地位进一步受到关注，3’-UTR中产生的新突变，有可能形成miRNA作用的靶基序。不仅如此，我们也在中国汉族群体中发现很多新的、中国人群所特有的SNPs。这些SNPs的发现将为清晰地揭示HLA表达的调控模式以及免疫疾病相关性的研究提供翔实的基础资料。HLA-E分子能在细胞表面表达且发挥免疫抑制功能，其表达也有独特性，目前对该基因及其分子功能研究越来越深入。虽然已经研制出了多种HLA-F特异性抗体(FG1、3D11、4A11和3D12)，但均未商品化，这可能是限制HLA-F研究的因素之一，深入了解HLA-F分子结构、受体及其作用机制、潜在的生物学功能及恶性肿瘤组织表达情况，将有助于开拓对肿瘤进行基础研究和临床治疗的思路。HLA-G分子在母胎免疫、感染、自身免疫病及肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。完整的HLA-E、-F、-G基因的全长序列，应包含8个外显子、7个内含子、5’-启动子和3’-UTR。截止2017年4月世界卫生组织WHO(WorldHealthOrganization)的HLA因子命名委员会命名的HLA-E等位基因有25个，HLA-F等位基因有22个,HLA-G等位基因有54个(参见IMGT/HLADatabase：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html)，IMGT/HLA数据库中基本没有已公布包含5’-启动子和3’-UTR的HLA-E、-F、-G等位基因全长序列。缺乏完整的外显子、内含子特别是5’-启动子及3’-UTR两端调控区序列，难以进行系统地HLA-E、-F、-G基因全长序列多态性分析和基因精确分型试剂盒的研发，大量HLA-E、-F、-G等位基因的全长序列有待填补。以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际HLA基因分型的金标准。该方法首先对需要分型的外显子区域进行PCR扩增即首先扩增目的基因片段，然后对纯化的PCR扩增产物进行测序反应、电泳检测和序列分析。目前国内各HLA分型和临床组织配型工作中的HLA基因测序分型试剂普遍依赖于进口。但国际上不同厂家的测序分型试剂盒，扩增HLA基因目的片段的分子大小和策略有所不同。由于商品化试剂盒较为昂贵，限制了HLA基因测序分型在群体遗传学和骨髓库中的大规模应用。
技术实现思路
为实现上述目的,本专利技术利用中国汉族个体样本建立稳定可靠的HLA-E、-F、-G基因全长序列测序方法，并对HLA-E、-F、-G基因全长序列多态性进行初步分析，以便为中国群体HLA-E、-F、-G全长序列多态性及分子进化研究、基因的表达调控、疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础。本专利技术的目的还在于提供一种适合于中国人群的HLA-E、-F、-G基因的测序分型方法。以便系统地对HLA-E、-F、-G基因的编码区进行测序分型。为实现上述目的，本专利技术提供一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定方法，该方法包括：各由一对位点特异性PCR扩增引物对HLA-E基因的3.8kb全长序列，HLA-F基因的3.5kb全长序列，HLA-G基因的3.1kb全长序列进行PCR扩增，扩增采用高保真的聚合酶(PrimeSTARGXLDNAPolymerase)，扩增区域包含三个基因的5’-启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及3’-UTR序列。扩增HLA-E3.8kb全长序列的PCR引物包括上游引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因全长序列测定的引物，所述引物选自E-genome-F和E-genome-R以及E-Genome-SF1至E-Genome-SF7，优选为E-genome-F和E-genome-R，或优选为E-Genome-SF1至E-Genome-SF7；/n其中E-genome-F的序列如SEQ ID NO:1所示，E-genome-R的序列如SEQ ID NO:2所示；E-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:7所示；E-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:8所示；E-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:9所示；E-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:10所示；E-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:11所示；E-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:12所示；E-Genome-SF7的序列如SEQ ID NO:13所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因全长序列测定的引物，所述引物选自E-genome-F和E-genome-R以及E-Genome-SF1至E-Genome-SF7，优选为E-genome-F和E-genome-R，或优选为E-Genome-SF1至E-Genome-SF7；
其中E-genome-F的序列如SEQIDNO:1所示，E-genome-R的序列如SEQIDNO:2所示；E-Genome-SF1的序列如SEQIDNO:7所示；E-Genome-SF2的序列如SEQIDNO:8所示；E-Genome-SF3的序列如SEQIDNO:9所示；E-Genome-SF4的序列如SEQIDNO:10所示；E-Genome-SF5的序列如SEQIDNO:11所示；E-Genome-SF6的序列如SEQIDNO:12所示；E-Genome-SF7的序列如SEQIDNO:13所示。


2.一种用于人类白细胞抗原HLA-F基因全长序列测定的引物，所述引物选自F-genome-F和F-genome-R以及F-Genome-SF1至F-Genome-SF6，优选为F-genome-F和F-genome-R，或优选为F-Genome-SF1至F-Genome-SF6；
其中F-genome-F的序列如SEQIDNO:3所示，F-genome-R的序列如SEQIDNO:4所示；F-Genome-SF1的序列如SEQIDNO:14所示；F-Genome-SF2的序列如SEQIDNO:15所示；F-Genome-SF3的序列如SEQIDNO:16所示；F-Genome-SF4的序列如SEQIDNO:17所示；F-Genome-SF5的序列如SEQIDNO:18所示；F-Genome-SF6的序列如SEQIDNO:19所示。


3.一种用于人类白细胞抗原HLA-G基因全长序列测定的引物，所述引物选自G-genome-F和G-genome-R以及G-Genome-SF1至G-Genome-SF6，优选为G-genome-F和G-genome-R，或优选为G-Genome-SF1至G-Genome-SF6；
其中G-genome-F的序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐筠娉，洪文旭，王宋兴，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：广东;44