表达PH敏感性免疫球蛋白序列的非人动物制造技术

本申请提供了基因修饰的非人动物，所述动物表达包括至少一个组氨酸的免疫球蛋白可变结构域，其中所述至少一个组氨酸由在所述动物的种系中针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者在种系免疫球蛋白核酸序列中插入的组氨酸密码子所编码。本申请还提供了免疫球蛋白基因，所述免疫球蛋白基因在一个或多个CDR中、在N-末端区中和/或在环4区中含有组氨酸。免疫球蛋白可变结构域包括一个或多个组氨酸(例如组氨酸簇)取代非抗原结合的非组氨酸残基。本申请还提供了非人动物，所述非人动物是包括经修饰的重链可变基因座(V、D、J区段)，经修饰的轻链可变基因座(V、J区段)和重排的种系轻链基因(VJ序列)的动物的后代。本申请提供了非人动物，所述非人动物产生以pH敏感的方式结合抗原的免疫球蛋白结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达PH敏感性免疫球蛋白序列的非人动物专利
一种基因修饰的非人动物，所述非人动物表达能够以pH依赖的方式与抗原结合的抗体。基因修饰的非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座被修饰以含有至少一个编码能够质子化的氨基酸的密码子的取代或插入。基因修饰的非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座被修饰以便在免疫球蛋白重链V、D或J基因区段，或轻链V或J区段，或其重排的重链VDJ区或其重排的轻链VJ区含有至少一个组氨酸取代和/或至少一个组氨酸插入。基因修饰的非人动物，所述非人动物表达在抗原结合中显示出pH敏感性的免疫球蛋白。基因修饰的动物，所述动物包含B细胞群，所述B细胞群富含包含至少一个组氨酸的免疫球蛋白可变结构域。基因修饰的非人动物，所述非人动物包含在免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，和或轻链V和/或J基因区段，和/或其重排的重链VDJ序列或重排的轻链VJ序列中以插入和/或取代形式存在的两个或多个组氨酸的簇。非人动物的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含至少一个组氨酸密码子的插入或至少一个组氨酸密码子对内源性非组氨酸密码子的取代。非人动物，包括啮齿动物，例如小鼠和大鼠，所述非人动物在其基因组中包含基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。能够表达抗原结合蛋白的基因工程改造的非人动物，所述抗原结合蛋白的特征为pH依赖性抗原结合、循环利用提高和/或血清半衰期增加。
技术介绍
治疗用途的免疫球蛋白结合结构域具有各种各样的形式，包括具有与同源轻链结合的同源二聚体免疫球蛋白重链的传统抗体形式。多种这些形式，包括传统形式，显示出由于各种各样的因素导致的在体内的药代动力学性质不理想。在最近的几十年中，已尝试了不同方法以改善药代动力学。这些包括例如通过与聚合物缀合增加流体力学半径以降低肾脏清除率(例如PEG；参见例如Duncan,R.(2006)Polymerconjugatesasanticancernanomedicines(作为抗癌纳米药物的聚合物缀合物),Nat.Rev.Cancer6:688-701)；N-聚糖的唾液酸化(参见例如Stork,R.等，N-glycosylationasnovelstrategytoimprovepharmacokineticpropertiesofbispecificsingle-chaindiabodies(作为改善双特异性单链双体药代动力学性质的新策略的N-糖基化),J.Biol.Chem.283(12):7804-7812)；用于促进在中性pH下Fc-FcRn结合而在内涵体pH下促进释放并与血清白蛋白结合的Fc修饰(参见例如Chuang等，(2002)PharmaceuticalStrategiesUtilizingRecombinantSerumAlbumin(利用重组血清白蛋白的制药策略),Pharm.Res.19(5):569-577)。在适当的应用中和使用适当形式时，这些方法中的每一种均可以提供一些益处。然而，在本领域中仍需要改善治疗效果和生物制药的模式，包括但不限于操纵免疫球蛋白可变结构域的结构以工程改造显示出pH依赖性结合的可变结构域。需要用于多种形式的抗原结合蛋白中的可变结构域，其中针对与靶抗原或受体的结合所述可变结构域(或其抗原结合片段)赋予了所述抗原结合蛋白pH敏感性。在本领域中还需要用于生成pH依赖性免疫球蛋白可变结构域及其抗原结合片段的系统和方法。需要能够产生具有广泛的多样性的免疫球蛋白可变结构域的生物系统，其中所述广泛的多样性富含可滴定的氨基酸，所述可滴定的氨基酸是可以赋予所述可变结构域pH敏感性，例如能够在一个pH下(例如中性的或较高的pH)与靶抗原或表位结合，而在另一个pH下(例如较低的或内涵体pH)释放靶抗原或表位。特定形式的免疫球蛋白轻链提出了特殊挑战。抗体通常包含同型二聚体的重链组分，其中各重链单体均与相同的轻链结合。具有异二聚体重链组分(例如双特异性抗体)的抗体是理想的治疗性抗体。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体的各个重链结合的适宜轻链组分的双特异性抗体已被证明是有问题的。在一种方法中，可以通过调查所有轻链可变结构域使用情况的统计数据，鉴定在人源抗体中使用频率最高的轻链并且在体外将轻链与具有不同特异性的两条重链配对来选择轻链。在另一种方法中，可以通过观察噬菌体展示文库(例如含有人源轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人源scFv文库)中的轻链序列并从该文库中选择最常用的轻链可变区来选择轻链。然后可以在两条不同的目的重链上对所述轻链进行检测。在另一种方法中，可以通过使用两条目的重链的重链可变序列作为探针检测轻链可变序列的噬菌体展示文库来选择轻链。可以选择与两条重链可变序列均结合的轻链作为所述重链的轻链。在另一种方法中，可以将候选轻链与所述重链的同源轻链比对，并且在所述轻链中进行修饰以便更加紧密地匹配与两条重链的同源轻链共有的序列特征。如果需要将免疫源性的可能最小化，则所述修饰优选地生成存在于已知的人源轻链序列中的序列，以使得蛋白水解加工根据用于评估免疫源性可能性的本领域公知的参数和方法(即在硅胶和湿分析法中)不可能生成T细胞表位。依赖于体外方法的所有此类方法包含多种先天缺陷，例如序列一致性，与特定预先选定的重链的结合能力等。现有技术中需要不依赖于体外条件操纵，取而代之的是使用在生物学上更为明智的方法以制备包含常见轻链的人源表位结合蛋白的组合物和方法。此外，治疗性抗体例如双特异性治疗性抗体具有一些局限性，因为其通常需要较高剂量以达到所需的疗效。这部分是由于抗体-抗原复合物被内化进入内涵体，并且在一个称为靶介导的清除过程中被作为溶酶体降解的靶点。因此，在现有技术中需要导致更有效的抗体循环例如双特异性抗体循环并通过促进在内涵体隔室中抗体-抗原复合物的解离但不影响抗体与抗原的特异性和亲和性的阻止抗体降解的方法和组合物。施用到体内的药物，包括治疗性单克隆抗体，受到多种消除机制的影响，包括肾小球滤过(例如进入尿液)、分泌(例如进入胆汁)和通过细胞的分解代谢。尽管小分子通过肾脏的滤过从机体中清除，但大多数的分泌抗体(例如IgG，因过大而无法通过肾小球被滤过)主要通过细胞介导的分解代谢从机体中除去，例如流体相的内吞作用(吞噬作用)或受体介导的内吞作用。例如，具有若干重复表位的可溶性分子与多个循环抗体结合，并且所得到的较大的抗原-抗体复合物被迅速地吞噬进入细胞降解。另一方面，与抗体结合的细胞表面靶受体(即受体-抗体复合物)以剂量依赖性的方式经历靶向介导的内吞作用，从而在细胞内形成最终被溶酶体降解的内涵体。在一些情况下，细胞内吞受体-抗体复合物以pH依赖性的方式在内涵体内结合新生儿Fc受体(FcRn)并且再返回细胞表面，并当暴露于细胞外的中性pH(例如pH7.0-7.4)下时释放进入血浆或细胞间液。在本领域中需要生产具有可滴定的残基的抗原结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包括在免疫球蛋白可变基因座中用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组氨酸密码子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.16 US 61/612,126;2012.03.16 US 61/611,950;1.一种制备基因修饰的非人动物的方法，所述方法包括修饰所述非人动物使其在其种系中包括第一免疫球蛋白可变基因座，所述第一免疫球蛋白可变基因座包括未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列，所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子，其中所述插入或取代的组氨酸密码子不由相应的野生型种系的未经重排的免疫球蛋白可变区核酸序列编码。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括修饰所述非人动物使其在其种系中包括第二免疫球蛋白可变基因座，所述第二免疫球蛋白可变基因座包括免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，所述免疫球蛋白轻链可变区核酸序列包括插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子，其中所述插入或取代的组氨酸密码子不由相应的野生型种系的免疫球蛋白可变区核酸序列编码。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座包括未经重排的重链可变区核酸序列的功能性部分，所述未经重排的重链可变区核酸序列的功能性部分包括未经重排的VH、DH和JH基因区段和所述插入或取代的组氨酸。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述未经重排的VH、DH和JH基因区段是未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述未经重排的VH、DH和JH基因区段是至少一个未经重排的人源VH基因区段、包含接头的合成的D区段和人源JH基因区段。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述合成的D区段包括至少一个组氨酸密码子。7.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括未经重排的轻链可变区核酸序列的功能性部分，所述未经重排的轻链可变区核酸序列的功能性部分包括未经重排的VL和未经重排的JL基因区段和所述插入或取代的组氨酸。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，所述重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列包括与JL基因区段重排的VL基因区段和所述插入或取代的组氨酸。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入或取代的组氨酸密码子是在编码可变结构域的核酸序列中并且所述组氨酸密码子在选自下述的区域中：免疫球蛋白链的N-末端区、免疫球蛋白链的环4区、重链的CDR1、重链的CDR2、重链的CDR3、轻链的CDR1、轻链的CDR2、轻链的CDR3及以上区域的组合。10.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座或第二免疫球蛋白可变基因座中的至少一个可操作地与在内源性非人源免疫球蛋白基因座的内源性非人源恒定区核酸序列连接。11.根据权利要求4所述的方法，其中所述未经重排的人源VH、未经重排的人源DH和未经重排的人源JH基因区段可操作地与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列连接。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座中。13.根据权利要求7所述的方法，其中所述未经重排的VL和未经重排的JL基因区段可操作地与内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列连接。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述可变区核酸序列包含2、3、4或5个组氨酸的簇，所述组氨酸的簇为组氨酸密码子对非组氨酸密码子的取代和/或组氨酸密码子的插入。16.根据权利要求4所述的方法，其中所述未经重排的重链基因座包含与所述重链基因座的方向相反的D基因区段。17.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白可变基因座包括包含所述插入或取代的组氨酸密码子的未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列，其中所述组氨酸密码子不是由相应的野生型种系基因区段编码；以及，其中所述第二免疫球蛋白可变基因座包括包含所述插入或取代的组氨酸密码子的未经重排的免疫球蛋白轻链可变区核酸序列，其中所述组氨酸密码子不是由相应的野生型种系基因区段编码。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列包括至少一部分功能性未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列，所述至少一部分功能性未经重排的人源免疫球蛋白重链...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·麦克沃克，L·麦克唐纳，J·H·马丁，A·J·莫菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US