多重ＰＣＲ检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种多重ＰＣＲ检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒，多重ＰＣＲ检测食品中肉类来源的引物组，由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，本发明专利技术的引物组可以应用于多重ＰＣＲ技术检测食品中肉类来源。本发明专利技术的试剂盒可以灵敏，快速地确定熟肉制品中的肉类来源，多重ＰＣＲ方法更是缩短了检测的时间，提高了检测的效率，将多重ＰＣＲ方法应用于食品检测领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程
，涉及多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及检测试剂盒。 
技术介绍
目前的肉制品市场中，一些单位和个人为了追求自身利益而以鸡肉充猪肉，以猪肉充牛肉等，用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，这极大的损坏了消费者的利益和健康。由于国家没有规定统一的肉类检测方法，也没有形成成熟、快速简便的检测肉类来源的行业方法，目前质监部门主要是通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别工作，这些传统鉴别方法对于市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用。但是，对于很多熟肉制品(如香肠)来说，加入的肉经过了粉碎处理，并且添加了香料掩盖了原有的味道，传统的方法难以进行准确的肉类来源鉴定。 目前，市场上经过加工的熟肉制品质量越来越难以鉴定，国家及地方各级质监部门急需要一种分析食品中的肉类来源的方法能够快速，有效的对肉类开源进行检测。分析食品中的肉类来源的方法主要有两种：应用抗体特异性的ELISA法和基于核酸特异性的PCR法。由于肉制品加工过程中蛋白质容易变性，导致ELISA法鉴定肉类来源的稳定性较差，容易出现偏差，且检测步骤复杂，时间长，不利推广。而PCR方法基于核酸的特异性，不受高温的影响。食品的肉类中含有大量的核酸分子，通过合成种属特异的引物并进行PCR，可以灵敏，快速的确定肉质中的肉类来源，如果找到一种能同时检测熟肉制品多种来源肉的种类，将可以大大缩短了检测的时间，提高了检测的效率，更利于应用于实际。 
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组。 本专利技术的第二个目的是提供一种多重PCR检测食品中肉类来源的试剂盒。 本专利技术的技术方案概述如下： 一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。 一种多重PCR检测食品中肉类来源的试剂盒，该试剂盒包括引物组、PCR管和2×Taq PCR反应混合试剂，所述引物组由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊 肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中-->SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。 本专利技术的引物组可以应用于多重PCR技术检测食品中肉类来源。本专利技术的试剂盒可以灵敏，快速地确定熟肉制品中的肉类来源，多重PCR方法更是缩短了检测的时间，提高了检测的效率，将多重PCR方法应用于食品检测领域。 附图说明图1应用多重PCR进行肉类来源分析的琼脂糖电泳图。 图中第1泳道是marker，第2条泳道是四重PCR结果，第3，4，5，6泳道分别是猪，牛，羊，鸡的单重PCR结果。 图2应用多重PCR进行市场中香肠肉类来源分析的琼脂糖电泳图。 图中第1泳道是DNAmarker(100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)，第2，3，4，5泳道分别是猪，牛，羊，鸡的单重PCR结果，第6泳道是牛肉肠A的多重PCR检测结果，第7泳道是牛肉肠B的多重PCR检测结果。 具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。 实施例1 本专利技术是对于食品中肉类来源的检测，通过PCR反应扩增出来的产物长度分别为猪：136bp，牛：705bp，羊：199bp，鸡：327bp。 一.肉制品中DNA的提取 样品处理：将等质量的猪、牛、羊和鸡肉组织样品研充分磨备用。 总DNA的提取：取30mg样品用200μl TE悬浮，加入400μl裂解液(5mol/L CuSCN；0.05mol/L Tris-HCl，pH6.4；0.02mol/L EDTA，pH8.0；1.3％TritonX-100)，70℃温浴10分钟，加等量氯仿混匀，离心(10000r/min，5min)，取上层水相，加等量冰乙醇-20℃沉淀10分钟，离心(10000r/min，5min)，弃上清，用70％乙醇洗涤一次，晾干，用50μlTE溶解沉淀；-20℃下保存待用。 二.引物的筛选和验证 首先，从GENEBANK查找获得相应的基因序列，针对要进行多重PCR反应的模板序列进行基因比对，找到特异性序列；然后，将特异性序列进行比对搜索，以确定该序列在所有物种中的特异性，避免序列出现重复现象，对选定序列两端进行微调，以确定最佳序列；其次，设计不同物种的PCR长度，至少相差50bp，从而确定上下游的引物序列，并保证所有引物的Tm值大致相同；最后用Primer软件进行分析，并微调引物序列，以确定引物之间没有过多的配对，没有二聚体。 1.引物筛选结果 猪5-ACTACTCATACCCAGCAAGC-3(序列表中SEQ ID NO.1所示) 5-TAAGGTGACAATAGGTAGTCCT-3(序列表中SEQ ID NO.2所示) 鸡5-TCCTCACTACTGTCATCTT-3(序列表中SEQ ID NO.3所示)--> 5-CTGGAAGAAGGAGTGATGGG-3(序列表中SEQ ID NO.4所示) 牛5-AAGCAATCGCTTTGTAACCC-3(序列表中SEQ ID NO.5所示) 5-CCAATTATTAGCAGGGTCATTG-3(序列表中SEQ ID NO.6所示) 绵羊5-CTGACCCCCTATATAAACCT-3(序列表中SEQ ID NO.7所示) 5-GTAAGGTTGTACTAATGAGGATC-3(序列表中SEQ ID NO.8所示) 2.引物特异性验证 分别提取猪、牛、羊、鸡肉制品的总DNA，将猪肉制品的总DNA、牛肉制品的总DNA、羊肉制品的总DNA和鸡肉制品的总DNA各1μl分别加入到50μl的PCR管中，再在每个PCR管中加入浓度为10μmol/L的步骤1获得的四种上下游引物各1μl，然后加入12.5μl的2×TaqPCR反应混合试剂后加3.5μl无离子H2O至25μl体系。将此PCR体系在5000转/分条件下离心30s。将反应体系放入PCR仪中，设定变性、退火和延伸时间和温度。 PCR检测方法的循环参数 反应完毕后将PCR产物取出，在4℃下短期保存，备用。 3.多重PCR反应 提取含有猪、牛、羊、鸡四种肉的混合肉制品的总DNA，取4μl加入50μl PCR管中，再各取浓度为10μmol/L的步骤1制备的四种上下游引物各1μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重ＰＣＲ检测食品中肉类来源的引物组，其特征是由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR检测食品中肉类来源的引物组，其特征是由检测猪肉引物对、检测鸡肉引物对、检测牛肉引物对和检测羊肉引物对组成，所述检测猪肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述检测鸡肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述检测牛肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述检测羊肉引物对的上下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。2.一种多重PCR检测食品中肉类来源...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔建军，孙艳华，张智禹，关丛笑，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]