检测TP63-NTRK2融合基因及其相对表达水平的引物、探针和方法技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光定量PCR技术检测肿瘤患者体内TP63‑NTRK2融合基因及其相对NTRK2基因的表达水平的引物、探针和方法，可筛查肿瘤患者体内是否有TP63‑NTRK2融合基因，同时检测NTRK2基因的相对表达量，对于肿瘤患者及时调整治疗方案、指导拉罗替尼用药、评价治疗效果、预测预后和预防临床复发具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
检测TP63-NTRK2融合基因及其相对表达水平的引物、探针和方法
本专利技术属生物技术检测领域，特别涉及一种筛查融合基因的方法，采用探针实时荧光PCR技术检测肿瘤患者体内TP63-NTRK2融合基因及其相对NTRK2基因的表达水平。
技术介绍
恶性肿瘤是目前全球疾病死亡的首位原因，严重威胁人类的健康。NTRK融合是一种致癌驱动基因，TP63-NTRK2融合基因是由TP63基因第6外显子和NTRK2基因第12外显子之间的融合形成的，其融合产物为嵌合蛋白，发挥非配体依赖性组成型激活作用，引发永久性信号级联反应，驱动癌细胞的生长。NTRK基因融合类型在多种成人和儿童的实体瘤中被发现。据报道，在比较常见的恶性肿瘤如肺癌、结直肠癌中NTRK基因融合的频率远低于5％，而在罕见的肿瘤类型如先天性婴儿纤维肉瘤、先天性中胚层肾癌、分泌型乳腺癌、涎腺乳腺样分泌癌中基因融合频率较高。其他的实体瘤还包括脑部恶性肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、胃肠道间质瘤等，在所有实体瘤中NTRK2基因融合的频率低于1％。近年来，随着技术的发展，以肿瘤驱动基因为靶点的个体化精准医疗彻底改变了恶性肿瘤的治疗格局，越来越多的分子靶向药物不断涌现。拉罗替尼(larotrectinib)是一种新型口服小分子、高选择性原肌球蛋白受体激酶(tropomyosinreceptorkinase，TRK)抑制剂。拉罗替尼主要通过与细胞内TRKB(NTRK2编码)的ATP位点竞争性结合，进而抑制TRK的催化活性和自磷酸化，阻断下游的信号通路传导，从而发挥抗肿瘤的作用。因此检测肿瘤患者体内TP63-NTRK2融合基因和NTRK2基因的相对表达量，对于肿瘤患者及时调整治疗方案、指导拉罗替尼用药、评价治疗效果、预测预后和预防临床复发具有重要意义。目前，检测NTRK基因融合的方法主要有免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交法(FISH)、第二代测序(NGS)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。免疫组化方法(IHC)尽管原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证；荧光原位杂交技术(FISH)被认为是检测基因融合的金标准。具有稳定性高、灵敏度高、特异性好，实验周期短等优点，但是它一次只能检测一个靶标，需要专门的组织和多目标部位检测，目前没有商业化的探针，有显著的假阳性(FP)或假阴性(FN)，且只能从DNA层面进行检测，且检测费用高；高通量测序技术可以并行地对数百万条短序列进行测序，已被广泛应用至对肿瘤突变的检测，然而目前的NGS方法只针对DNA测序进行判断，容易造成RNA层面的漏检；相对于二代测序后期数据处理复杂，实时荧光定量PCR检测结果直观，容易判断，同时具有操作简单，成本低廉等特点。本研究采用实时荧光定量PCR技术，具有特异性好、灵敏度高、线性关系好、操作简单、自动化程度高、防污染、有较大的线性范围等优点，可以检测微小残留病灶，为了解病情进展和治疗效果提供依据，同时实时荧光定量PCR也存在假阳性和假阴性率较高、引物设计不好会影响检出等缺点。但是该技术在检测上已经相当成熟，实用好，结果比较可靠稳定，可作为检测TP63-NTRK2基因融合和NTRK2基因的相对表达量的首选方法，用于指导拉罗替尼用药、评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于TP63-NTRK2基因融合和NTRK2基因的相对表达量的检测。前人对融合基因的研究只关注融合基因本身的情况，而没有考虑相关正常基因的表达情况，无法得知融合基因表达量相对正常基因表达量的水平。
技术实现思路
本专利技术设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用实时荧光PCR技术，筛查患者体内TP63-NTRK2融合基因及其相对NTRK2基因的表达水平。该方法快速准确，灵敏度高，特异性好，检测通量大。本专利技术提供正常基因的表达量做参考，可为拉罗替尼临床用药及相关治疗提供更多的参考。用于筛查患者体内TP63-NTRK2融合基因及其相对NTRK2基因的表达水平的检验试剂中，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit(TOYOBO公司)、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)、检测目的基因用上下游引物分别为：TP63-E6-F、NTRK2-E11-F、NTRK2-E12-R，探针为NTRK2-E12-P，检测内参基因Actin用引物为Actin-F，Actin-R，探针为Actin-P。其中，TP63-E6-F：GACAGGAAGGCGGATGAAGANTRK2-E12-R：AGTGGGCTGGCAGAGTCATCNTRK2-E12-P：FAM-TCATTGCTGATAACGGAGGCTGGG-TAMRANTRK2-E11-F：TTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTActin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-P:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。。具体地，所述阳性对照品分别为含有TP63-NTRK2融合基因和NTRK2基因的溶液；所述阴性对照品为不含TP63-NTRK2融合基因和NTRK2基因组溶液。本专利技术还提供了一种检测TP63-NTRK2融合基因及其相对NTRK2基因的表达水平的方法，包括如下步骤：1)抽提组织中的总RNA并逆转录为cDNA；2)以步骤1中的cDNA为模板，利用检测用上/下游引物TP63-E6-F/NTRK2-E12-R和探针NTRK2-E12-P，检测样本中是否有TP63-NTRK2融合基因；利用检测用上/下游引物NTRK2-E11-F/NTRK2-E12-R和探针NTRK2-E12-P，检测样本中的NTRK2基因的相对表达量；利用内参基因上/下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe定量检测样本中的Actin的表达量；3)根据Real-timePCR结果来分析样本是否有TP63-NTRK2基因融合及其相对NTRK2基因的表达水平；步骤1)中，所述的提取方法为常规的TRIZOL法提取血液RNA，然后用TOYOBO公司的ReverTraAceqPCRRTKit试剂盒反转录成cDNA。步骤2)所述的的Real-timePCR扩增方法如下：一例样本的qPCR体系为25ul：2*qPCRMIX12.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测肿瘤患者体内TP63-NTRK2融合基因和其相对NTRK2基因的表达水平的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增TP63-NTRK2融合基因和NTRK2基因的引物和探针分别为：/nTP63-E6-F：GACAGGAAGGCGGATGAAGA/nNTRK2-E12-R：AGTGGGCTGGCAGAGTCATC/nNTRK2-E12-P：FAM-TCATTGCTGATAACGGAGGCTGGG-TAMRA/nNTRK2-E11-F：TTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTT。/n

【技术特征摘要】
1.检测肿瘤患者体内TP63-NTRK2融合基因和其相对NTRK2基因的表达水平的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增TP63-NTRK2融合基因和NTRK2基因的引物和探针分别为：
TP63-E6-F：GACAGGAAGGCGGATGAAGA
NTRK2-E12-R：AGTGGGCTGGCAGAGTCATC
NTRK2-E12-P：FAM-TCATTGCTGATAACGGAGGCTGGG-TAMRA
NTRK2-E11-F：TTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTT。


2.根据权利要求1所述的检测肿瘤患者体内TP63-NTRK2融合基因和其相对NTRK2基因的表达水平的引物和探针，其特征在于，还包括扩增Actin内参基因的引物和探针，分别为：
Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-P：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。


3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，TP63-E6-F：NTRK2-E12-R：NTRK2-E12-P的摩尔比为2：2：1。


4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，NTRK2-E11-F：NTRK2-E12-R：NTRK2-E12-P的摩尔比为2：2：1。


5.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，Actin-F：Actin-R：Actin-P的摩尔比为1：1：1。


6.检测肿瘤患者体内TP63-NTRK2融合基因和其相对NTRK2基因的表达水平的方法，包括以下步骤：
(1)抽提组织中的总RNA并逆转录...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪青，王淑一，
申请(专利权)人：福州艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35