用于检测肠癌的标记物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于检测肠癌的标记物及其应用，具体涉及用于检测肠癌的标记物，还涉及所述标记物在检测肠癌中的应用以及相关的试剂盒和检测方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肠癌的标记物及其应用本申请为分案申请，原申请的申请号为201710371888.3(201410403598.9)，申请日为2014年8月15日，专利技术名称为“用于检测肠癌的标记物及其应用”。
本专利技术属于生物学和医学检验领域，涉及用于检测肠癌的标记物，还涉及所述标记物在检测肠癌中的应用以及相关的试剂盒和检测方法。
技术介绍
肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60％。随着人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,发病多在40岁以后，男女之比为2:1。目前.结直肠癌早期诊断的方法包括大便隐血检测(Fecaloccultbloodtest,FOBT)、结肠镜检测(Colonoscopy)、粪便DNA突变检测和粪便RNA特异性基因检测等，钡灌肠(Double-contrastbariumenema，DCBE)等。结肠镜检测被认为是诊断结直肠癌的金标准，但是它为侵入性检查，需要肠道准备，检查过程中有发生并发症如出血及穿孔危险，患者接受性不高，且花费较大。大便隐血检测虽然为非侵入性检测，但是检查结果容易受饮食等因素的影响，并且对于筛查结直肠癌而言.粪便隐血检测的灵敏度和特异性不够理想。成熟的microRNA(miRNA)是一类不编码蛋白质的单链的RNA，由18－24个碱基组成，与相应的mRNA结合导致mRNA分解或沉默，从而起到对基因的调节作。近年来的研究显示，miRNA的特异性表达与肿瘤的发生和发展有关，某些miRNA甚至可以起到抑癌基因或癌基因的作用。环氧化酶(COX)是前列腺素合成过程中的重要限速酶，COX2在正常组织中不表达，但可在各种刺激因素的作用下诱导表达，故又被称为诱导型早期反应基因，与肿瘤的发生、发展密切相关，近年来的研究发现，COX2在大部分头颈肿瘤中过表达，Cox2也是肠癌的生物标志之一。因此，如果能够研发出的相应的肠癌试剂盒使之能够应用于科研领域，将极大地促进肠癌筛查研究及科研成果的转化，对于肠癌的诊疗必将起到巨大的推动作用。
技术实现思路
本专利技术人研究发现，miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a的上调表达与人类多种肿瘤(如肠癌)的发生、发展相关，提示对检测粪便和血清miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a的表达检测可以成为肿瘤如肠癌检测的指标之一。本专利技术提供用于检测肠癌的引物、探针和试剂盒(尤其是用于检测粪便和血清miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a和COX2)的核酸及检测方法。本专利技术包括以下技术方案：1.肠癌检测试剂盒，其包含选自SEQIDNO:9-27所示的引物和/或探针。2.上述1所述的试剂盒，其包含选自SEQIDNO:9-15所示的一种或多种引物。3.上述1或2所述的试剂盒，其包含SEQIDNO:23所示的引物。4.上述1－3中任一项所述的试剂盒，其包含SEQIDNO:24和/或27所示的探针。5.上述1－4中任一项所述的试剂盒，其包含选自SEQIDNO:16－22和25－26所示的一种或多种引物。6.上述1－5中任一项所述的试剂盒，其包含选自以下的一组或多组引物和探针：SEQIDNO:9、16、23和24；SEQIDNO:10、17、23和24；SEQIDNO:11、18、23和24；SEQIDNO:12、19、23和24；SEQIDNO:13、20、23和24；SEQIDNO:14、21、23和24；SEQIDNO:15、22、23和24；和SEQIDNO:25-27。7.上述1－6中任一项所述的试剂盒，其中所述探针带有荧光标记。8.上述7所述的试剂盒，其中所述探针的5'用FAM标记，而所述探针的3'用TAMRM标记。9.试剂在制备肠癌检测试剂盒中的用途，其中所述试剂用于测定选自以下的一种或多种标记物：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a和COX2，所述试剂优选选自SEQIDNO:9-27所示的一种或多种引物和/或探针。10.肠癌检测方法，包括检测样品中选自以下的一种或多种标记物的水平：miRNA-92a、miRNA-135b、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-19、miRNA-223、miRNA-301a和COX2，所述样品优选为粪便和/或血清样品，优选使用选自SEQIDNO:9-27所示的一种或多种引物和/或探针检测所述标记。本专利技术的试剂盒和方法采用水解探针法TaqMan技术的设计方法(图1)，除了一对特异性引物，用TaqMan探针法增加一条与模版互补的基因特异性探针(通常20—30bp)，特异性高。此外，探针上5'端和3'端还可以分别标记一个荧光报告基团，增强灵敏度。本专利技术的引物、探针、试剂盒和方法适用肠癌患者的检测和诊断。用于肠癌检测的引物和探针优选为：(1)用于检测miRNA-92a的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：miRNA-92a-RT(逆转录引物)：5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGCCAGGCC-3'；miRNA-92a-F：5'-CTGCTGCTATTGCACTTGTCC-3'；通用下游引物(miRNA-92a-R)：5'－GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3'；通用探针(miRNA-92a-B)：5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3'；(2)用于检测miRNA-135b的逆转录引物、探针及检测引物如下所示：miRNA-135b-RT(逆转录引物)：5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTCCACGCCTGCCGTTCGCACTGGATGCACTGGTTGAGCTCACAT-3'；miRNA-135b-F：5'-TGCTGCTATGGCTTTTCATTCCT-3’；通用下游引物(miRNA-135b-R)：5'-GCTCAACCAGTGAGGCGTC-3'；通用探针(miRNA-135b-B)：5'-CGCCTGCCGTTCGCACTGGAT-3'；(3)用于检测miRNA-18a的逆转录引物、探针及检测引物逆转录引物如下所示；miRNA-18a-RT(逆转录引物)：5'-GCTCAACCAGTGAGGCGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肠癌检测试剂盒，其包含SEQ ID NO:23所示的引物和/或SEQ ID NO:24所示的探针。/n

【技术特征摘要】
1.肠癌检测试剂盒，其包含SEQIDNO:23所示的引物和/或SEQIDNO:24所示的探针。


2.权利要求1的试剂盒，其包含用于测定选自以下的一种或多种标记物的试剂：miRNA-19a、miRNA-135b、miRNA-92a、miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-223、miRNA-301a和COX2。


3.权利要求2的试剂盒，其包含用于测定miRNA-19a的试剂，所述试剂任选包含选自SEQIDNO:13和20所示的引物。


4.权利要求2或3所述的试剂盒，其还包含一种或多种选自9-12、14-19、21-22和25-27所示的引物或探针。


5.权利要求4所述的试剂盒，其还包含选自以下的一组或多组引物和探针：
SEQIDNO:9和16；
SEQIDNO:10和17SEQIDNO:11和18；
SEQIDNO:12和19；
SEQIDNO:14和21；
SEQIDNO:15和22；和
SEQIDNO:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：于浩洋，苏静，陈勉乔，
申请(专利权)人：深圳市晋百慧生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44