DNA甲基化检测方法及相关应用技术

本公开提供用于DNA甲基化检测的方法、试剂、试剂盒及相关的应用，进一步提供RNF180基因或Reprimo基因甲基化的检测方法、核酸、试剂盒和应用，所述方法、核酸、试剂盒等可用于癌症诊断和/或预后。

DNA methylation detection methods and related applications

【技术实现步骤摘要】
DNA甲基化检测方法及相关应用本申请是申请号为201811074552.1、申请日为2018年9月14日、专利技术名称为“DNA甲基化检测方法及相关应用”的专利申请的分案申请。
本公开属于生物
，涉及体外诊断技术。具体地讲，本公开涉及用于DNA甲基化检测的方法、试剂、试剂盒及相关的应用，涉及用于癌症诊断和/或预后的方法、产品(包括试剂、试剂盒)。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类生命健康的一类重大疾病。虽然肿瘤的治疗有了长足的进步，但高死亡率仍未得到有效控制。根据国家癌症中心最新一期的全国癌症统计数据(来源于2017年全国肿瘤登记中心收集汇总的全国31省市自治区肿瘤登记处2014年的恶性肿瘤登记资料)显示，全国恶性肿瘤新发病例数380.4万例，标化发病率174.0/10万，略低于世界平均水平182.3/10万。但中国癌症发病约占全球的22％，发病人数全球第一。中国癌症死亡病例超200万，约占全球的27％，标化死亡率122.2/10万，高于世界平均水平102.4/10万。由于缺乏癌症早筛以及就诊时间偏晚等原因，中国癌症的5年生存率仅为30.9％，而发达国家普遍在70％以上。以胃癌为例，我国每年新增胃癌病例约68万，死亡人数约49.8万；发病人数约占世界年新发病例数的50％。胃癌患者5年生存率与介入时期密切相关，中晚期胃癌5年生存率低于15％，而早期胃癌患者5年生存率超过90％。因此提升胃癌早期诊断和筛查水平，对于控制胃癌人群增长、延长患者生存期和提高生存质量均有重要意义。现阶段，内镜(胃镜)为主的影像学检查广泛应用于临床和体检。结合切片病理分析，胃镜检查可发现早期胃癌黏膜改变，但仍存在IIb型早期胃癌难发现，活检准确取材成功率不稳定导致误诊风险等问题。且胃镜依从性较差，70％的受检人会因其侵入性产生恐惧、紧张和焦虑情绪，所以多数患者，尤其老年人，不愿意接受胃镜检查。而由于操作人员经验不足或设备清洁不当导致的上消化道损伤和交叉感染的情况也时有报道。其它如X射线或CT扫描等影像检查手段多应用于术前评价和手术方案制定，早期诊断意义有限。而蛋白分子标志物，如CEA及CA19-9等的检测，对胃癌特异性较低，通常作为预后监测指标。综上，开发新型胃癌早期诊断技术，实现胃癌早期、灵敏、特异诊断，意义重大。近年来，研究发现分离自肿瘤患者血浆的DNA中存在基因甲基化水平异常；基因甲基化可能是肿瘤发生、发展的重要分子特征。环指蛋白180(ringfingerprotein180，RNF180)具有抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用，参与胃癌的淋巴转移。近年研究发现RNF180基因的启动子序列内的CpG位点甲基化状态与胃癌发生、病程发展和患者预后之间关系紧密。一些研究提示，RNF180基因甲基化检测可能具有胃癌体外分子诊断的应用价值。Reprimo是一种糖基化胞浆蛋白，作为p53的下游效应器，引起细胞周期的G2/M期阻滞，具有抑制细胞增殖的作用。据报道，在胃癌中，Reprimo作为抑癌基因，由于启动子区域的异常甲基化状态，其表达在部分样本中缺失。研究提示，Reprimo或其甲基化在胃癌诊断方面可能具有潜在的应用价值。传统的甲基化检测包括甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性荧光PCR法(methylight)及亚硫酸氢盐测序法。甲基化特异性PCR(MSP)及甲基化特异性荧光PCR法(methylight)均是通过对样本DNA进行亚硫酸盐处理，在保留甲基化胞嘧啶的同时将非甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶；再分别通过甲基化/非甲基化特异性的引物来进行PCR配合琼脂胶电泳后显影或使用荧光PCR发光法来检测样本DNA中的甲基化程度。亚硫酸盐测序同样先对样本DNA进行亚硫酸盐处理并用通用引物(不含有CpG岛，因此可用同时扩增甲基化模板及非甲基化模板)进行PCR扩增；再将扩增产物进行测序，根据甲基化序列与非甲基化序列的差异来识别样本DNA中的甲基化位点及程度。但亚硫酸氢盐测序法成本高、通量低、操作繁琐，不利于广泛应用于早期诊断及筛查。而甲基化特异性PCR(MSP)及甲基化特异性荧光PCR法(methylight)在引物特异性上始终存在缺陷，甲基化引物也有一定概率可以通过错配而扩增非甲基化模板：理论上，单个引物含有的CpG序列不会超过3个，因此非甲基化模板的一对引物至多只有6个碱基位点与甲基化引物不匹配。而甲基化检测的样本是甲基化模板与非甲基化模板的混合物，且非甲基化模板通常占到总模板量的90％以上，故MSP及methylight存在假阳性的缺陷。因此，特异性地排除掉甲基化引物错配到非甲基化模板在实际测量中显得尤为重要。
技术实现思路
：为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术人进行了大量的研究，提供以下技术方案。1.一种DNA甲基化检测方法，该方法包括：(1)用甲基化敏感性限制性内切酶处理一部分DNA样本，和(2)对于经过所述酶处理过的DNA样本和未经所述酶处理的DNA样本，对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增，根据经过所述酶处理的DNA样本的扩增结果和未经所述酶处理的DNA样本的扩增结果，确定所述基因的甲基化情况。2.一种DNA甲基化检测试剂盒，其中所述试剂盒包含：甲基化敏感性限制性内切酶和用于DNA扩增的试剂。3.甲基化敏感性限制性内切酶在制备DNA甲基化检测试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含用于DNA扩增的试剂。4.根据项2或3所述的试剂盒或用途，其中所述试剂包括用于对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增和/或检测的试剂，例如扩增引物和/或检测探针。5.根据项1-4中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割未甲基化序列或切割甲基化序列。6.根据项1-5中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割未甲基化序列，所述酶优选为选自在酶识别序列中含有CpG的甲基化敏感性限制性内切酶，更优选为选自BstUI酶、HpaII酶和HhaI酶的一种或更多种酶。7.根据项1-5中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割甲基化序列，所述酶优选为选自在酶识别序列中含有CpG的甲基化特异性限制性内切酶，更优选为McrBC。8.根据项4-7中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所使用的上游和/或下游扩增引物和/或检测探针含有所述酶所识别的序列。9.根据项1-8中任一项所述的方法、试剂盒或用途，所述方法或试剂盒用于癌症的诊断和/或预后；所述癌症优选为选自胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌和头颈癌中的一种或更多种癌，更优选为胃癌。10.根据项1-9中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述待测DNA为RNF180基因，优选扩增RNF180基因中包含选自SEQIDNO:1-3的序列、或扩增选自SEQIDNO:1-3的序列。11.根据项10所述的方法、试剂盒或用途，其中所述扩增引物和/或探针包含或为选自SEQIDNO:4-6的序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA甲基化检测方法，该方法包括：/n(1)用甲基化敏感性限制性内切酶处理一部分DNA样本，/n(2)对于经过所述酶处理过的DNA样本和未经所述酶处理的DNA样本，对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增，/n根据经过所述酶处理的DNA样本的扩增结果和未经所述酶处理的DNA样本的扩增结果，确定所述基因的甲基化情况。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化检测方法，该方法包括：
(1)用甲基化敏感性限制性内切酶处理一部分DNA样本，
(2)对于经过所述酶处理过的DNA样本和未经所述酶处理的DNA样本，对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增，
根据经过所述酶处理的DNA样本的扩增结果和未经所述酶处理的DNA样本的扩增结果，确定所述基因的甲基化情况。


2.一种DNA甲基化检测试剂盒，其中所述试剂盒包含：甲基化敏感性限制性内切酶和用于DNA扩增的试剂。


3.甲基化敏感性限制性内切酶在制备DNA甲基化检测试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含用于DNA扩增的试剂。


4.根据权利要求2或3所述的试剂盒或用途，其中所述试剂包括用于对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增和/或检测的试剂，例如扩增引物和/或检测探针。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割未甲基化序列或切割甲基化序列。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：于浩洋，梁宁，吕禾，
申请(专利权)人：深圳市晋百慧生物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44