一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法技术

本发明专利技术属于DNA序列检测技术领域，公开了一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法，对不同突变位点的基因序列，设计相应的Guiding链；合成制备所需的Guiding链；将Guiding链与探针检测体系混合，使Guiding链与底物链的比例为2:1；向上述混合体系加入Endo IV，使底物链转化为长度更长的DNA双链，并进行实时荧光测定。本发明专利技术涉及的调控内切酶IV/APE‑1/lambda外切酶活性，降低了由于核酸酶副活性而产生的背景信号，同时最大程度的保留核酸酶切割目标序列的主活性，从而提高检测效能。

A method for specific regulation of nuclease activity

【技术实现步骤摘要】
一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法
本专利技术属于DNA序列检测
，尤其涉及一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法。
技术介绍
目前，核酸酶是生物学、化学和医学研究中被广泛使用的工具。它们被广泛应用于生物传感器、基因编辑技术和新药物的研制上。不同的核酸酶具有不同的切割特性，对应的底物也各不相同。在实际应用的层面，目前对核酸酶的应用都是基于其可以预测的工作机制。例如，我们通常希望EndoIV能够稳定且专一地切割具有空位的DNA双链。然而，核酸酶容易受到体系中其他核酸链的干扰，其切割特性并不稳定。尤其是对于以双链DNA为靶目标链的核酸酶，它们经常非特异性地切割核酸单链。这一现象往往导致意料之外的串扰，对核酸酶在各个领域的应用形成很大的限制。在酶-核酸探针领域，广泛使用的lambdaexonuclease，APE1和EndoIV均易发生预料之外的非特异酶切现象，严重限制了酶-探针检测体系的实际应用。因为在酶-探针检测体系中，不与野生链结合的核酸探针以单链的形式大量存在。如果核酸酶切割单链核酸探针，荧光信号就会作为背景信号大量产生，导致突本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，所述对核酸酶活性进行特异性调控的方法包括：/n步骤一，对不同突变位点的基因序列，设计相应的Guiding链；/n步骤二，合成制备所需的Guiding链；/n步骤三，将Guiding链与探针检测体系混合，使Guiding链与底物链的比例为2:1；/n步骤四，向上述混合体系加入Endo IV，使底物链转化为长度更长的DNA双链，并进行实时荧光测定。/n

【技术特征摘要】
1.一种对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，所述对核酸酶活性进行特异性调控的方法包括：
步骤一，对不同突变位点的基因序列，设计相应的Guiding链；
步骤二，合成制备所需的Guiding链；
步骤三，将Guiding链与探针检测体系混合，使Guiding链与底物链的比例为2:1；
步骤四，向上述混合体系加入EndoIV，使底物链转化为长度更长的DNA双链，并进行实时荧光测定。


2.如权利要求1所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，步骤一设计Guiding链的方法包括：
步骤1，确定底物链的探针杂交域，所述底物链为待检测的目标序列；
步骤2，设计两条DNA单链，所述DNA单链为Guiding链，使两条Guiding链其与底物链的探针杂交结构域外的部分互补，一起构成核酸酶优先结合的长双链结构。


3.如权利要求2所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，Guiding链的长度大于20-nt。


4.如权利要求2所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，若突变位置过于靠近底物链5’或3’端，只引入一条Guiding链与底物杂交结构域外互补。


5.如权利要求2所述的对核酸酶活性进行特异性调控的方法，其特征在于，步骤四进行实时荧光测定的方法包括：
步骤I，设计反应体系，合成制备寡核苷酸链；反应体系包括核酸酶，探针，缓冲液，H2O和双链DNA；探针序列为SEQIDNO：1，引物序列为SEQIDNO：2，双链DNA为序列包括SEQIDNO：3、SEQIDNO：4；
步骤II，配置反应体系，在400uL酶标条中，加入100nM探针，5uLThermoPol缓冲液，0.1单位EndoIV或2单位APE-1或2单位lambdaexo，并用去离子水补齐到50uL总体积；
步骤III，向上述反应体系中加入不同量，不同长度的双链DNA，放入荧光检测仪器中，进行实时荧光测定；
热程序：37...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖先金，明志浩，章伟，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42