本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用。本发明专利技术利用连接酶反应提高了单碱基错配的识别能力，利用LAMP获得高灵敏度，从而建立了基于连接酶的LAMP检测SNP的新方法，该方法可以检测到浓度为100aM的DNA。同时我们将此方法应用于人全血基因组DNA样品检测，获得了与DNA测序一致的结果；该方法对基因突变具有很高的选择性，可测定0.1％突变频率。例如选拔优秀运动员时，需进行能力评定，可以通过检测其血液中有氧能力、代谢效率、训练敏感性、心脏猝死和运动损伤风险等相关基因的SNP类型，对其未来运动能力水平和运动风险进行预测。
Primer probe combination, kit and its application in detecting mutation of ACTN3 gene
【技术实现步骤摘要】
引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用。
技术介绍
人类基因组中最常见的基因突变是SNP。人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP，所以SNP是人类基因组中密度最大的遗传标记。SNP发生频率较高，被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记，在医学遗传学、药物遗传学、疾病遗传学、疾病诊断学以及人类进化等研究领域都有着很高的研究价值和应用前景。ACTN3基因的SNPs与人体运动能力潜在相关，ACTN3R77X是ACTN3基因位于rs1815739位置的多态性，控制了α-肌动蛋白-3的合成，这是一种Z结构蛋白，主要存在于快肌肉纤维中，通过加速糖酵解和促进“爆发性”强收缩为肌肉提供能量。ACTN3突变纯合子因为基因突变造成了α-肌动蛋白-3早期停止密码子完全缺失，导致蛋白表达丧失，使得肌肉代谢向更有效的有氧途径转移，从而提高身体内在耐力性能。最近对运动员和普通人群的研究进一步表明，ACTN3基因还影响骨骼肌对运动训练的适应性反应。检测ACTN3基因的SNP是评价运动员耐力水平和训练的有效手段之一。在SNP分析中，往往根据实际样品的性质和不同实验目的来确定检测方法。SNP检测方法有多种。在运动科学实验研究中，大多数检测都采用常规方法，如PCR-RFLP和Sanger测序法，这些方法灵敏度高，但操作复杂，分析成本较高。目前，SNP检测主要用PCR、RCA等DNA扩增方法对样品进行信号放大，然后用实时荧光定量PCR进行信号检测，结合了荧光染料放大能力和扩增的高灵敏度，但也存在一些缺点，如操作复杂、选择性低及需要高精确度的温度循环仪器等。环介导等温扩增技术(LAMP)是目前核酸分析的最灵敏的技术，最低可以检测到低于10个拷贝的DNA分子，而且是等温扩增，不需要热循环过程，但存在一些不足之处，一是对单碱基错配的识别能力不高，二是需要将目标序列分为六个区域，设计四个特异性扩增引物，引物设计还要考察二级结构，保证扩增的特异性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用。本专利技术基于连接酶的LAMP方法为SNP检测提供了一种全新的恒温、均相、无标记、高灵敏检测技术，从而实现运动员基因型的高效检测和运动训练学评价。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了引物探针组合，所述引物包括FIP、BIP、PrimerF和PrimerR；所述探针包括Probe-wild-A、Probe-mutant-A、Probe-wild-B和Probe-mutant-B；所述FIP的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；所述BIP的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述PrimerF的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；所述PrimerR的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示；所述Probe-wild-A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述Probe-mutant-A的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述Probe-wild-B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述Probe-mutant-B的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的引物探针组合在制备检测ACTN3基因突变的试剂或试剂盒的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述ACTN3基因突变位于rs1815739。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的引物探针组合在制备检测运动员的耐力性能和/或训练成果的试剂或试剂盒中的应用。本专利技术还提供了包括如权利要求1所述的引物探针组合的试剂盒。在本专利技术的一些具体实施方案中，还包括Ampligase热稳定DNA连接酶。本专利技术还提供了检测运动员的耐力性能和/或训练成果的方法，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品的DNA；步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用所述的引物探针组合或所述的试剂盒，扩增；步骤3、根据步骤2中所述扩增的结果判定所述待测样品的耐力性能和/或训练成果。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述判定的标准为：(1)当Wild-DNA探针先出现荧光信号Mutant-DNA探针不出现荧光信号时，样品测序结果显示SNP位点存在单一的胞嘧啶C碱基信号，鉴定为ACTN3野生纯合子DNA；(2)当Mutant-DNA探针先出现荧光信号Wild-DNA探针不出现荧光信号，样品测序结果显示SNP位点存在单一的胸腺嘧啶T碱基信号，鉴定为ACTN3突变纯合子；(3)用Mutant-DNA探针和Wild-DNA探针DNA检测荧光曲线POI值趋向一致时，测序结果显示SNP位点同时产生胞嘧啶和胸腺嘧啶C/T碱基信号，鉴定为ACTN3杂合子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增包括连接反应和LAMP反应；10μL的所述连接反应的体系中包含1μL10×Ampligase反应缓冲液(200mMTris-HCl，pH＝8.3，250mMKCl，100mMMgCl2，5mMNAD，0.1％TritonX-100)，1UAmpligase热稳定DNALigase，1μL1μM如权利要求1所述的引物探针组合，不同浓度的1μLDNA或人基因组DNA，5.8μLH2O，在95℃下加热3分钟，在65℃下加热30min；所述LAMP反应为：取所述连接反应的产物2μL，加入0.4μMFIP和BIP引物，2.5mMdNTPs0.8μL，2μL甜菜碱，0.8μL10×ThermoPol反应缓冲液(包含200mMTris-HCl，100mMKCl，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4和1％TritonX-100、pH8.8)，然后迅速加入含有0.2μL10×ThermoPol反应缓冲液、0.2μL20×SYBRGreenI，2UBstDNA聚合酶大片段和H2O的混合溶液，溶液最终体积为10μL，将最终的混合溶液在65℃下进行LAMP反应，每隔1min检测和采集实时荧光强度数据。本专利技术利用连接酶的连接反应，建立了一种基于连接酶的LAMP检测ACTN3基因SNP的方法。它仅需要等温条件进行扩增，同时利用Ampligase热稳定DNA连接酶对目标序列SNP位点进行特异性识别后连接，利用连接探针的引发LAMP扩增，使用荧光染料嵌入法进行实时荧光定量，避免了对探针的荧光标记，检测效率和特异性得到了大大提高，从而可以建立快速、灵敏的SNP检测分析方法。我们提取了38名中国马拉松运动员全血基因组DNA样品，并测定了ACTN3SNP类型，进行了运动员SNP类型和耐力指标相关性分析。该方法简化了实验步骤，可最低检测出100aMDNA，并成功应用于人基因组DNA样品检测，可以从野生型DNA中精确测量0.1.％的突变DNA频率。本专利技术研究的基于连接酶的LAMP方法为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物探针组合，其特征在于，所述引物包括FIP、BIP、Primer F和Primer R；所述探针包括Probe-wild-A、Probe-mutant-A、Probe-wild-B和Probe-mutant-B；/n所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；/n所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；/n所述PrimerF的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；/n所述Primer R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；/n所述Probe-wild-A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；/n所述Probe-mutant-A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；/n所述Probe-wild-B的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；/n所述Probe-mutant-B的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。/n
【技术特征摘要】
1.引物探针组合，其特征在于，所述引物包括FIP、BIP、PrimerF和PrimerR；所述探针包括Probe-wild-A、Probe-mutant-A、Probe-wild-B和Probe-mutant-B；
所述FIP的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示；
所述BIP的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；
所述PrimerF的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；
所述PrimerR的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示；
所述Probe-wild-A的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；
所述Probe-mutant-A的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；
所述Probe-wild-B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；
所述Probe-mutant-B的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测ACTN3基因突变的试剂或试剂盒的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ACTN3基因突变位于rs1815739。
4.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测运动员的耐力性能和/或训练成果的试剂或试剂盒中的应用。
5.包括如权利要求1所述的引物探针组合的试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括Ampligase热稳定DNA连接酶。
7.检测运动员的耐力性能和/或训练成果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、提取待测样品的DNA；
步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物探针组合或如权利要求5或6所述的试剂盒，扩增；
步骤3、根据步骤2中所述扩增的结果判定所述待测样品的耐力性能和/或训练成果。
8.如权利要求7所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：张栋，史东林，柴建中，赵宁宁，杨泽宇，杨丹，
申请(专利权)人：河北省体育科学研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13
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