一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物、探针和方法技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光定量PCR技术，一管式筛查肿瘤患者体内ETV6‑NTRK3融合基因的引物、探针和方法，可筛查肿瘤患者体内是否有ETV6‑NTRK3融合基因，对于肿瘤患者及时调整治疗方案、指导拉罗替尼用药、评价治疗效果、预测预后和预防临床复发具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物、探针和方法
本专利技术属生物技术检测领域，特别涉及一种筛查融合基因的方法，采用探针Taqman实时荧光PCR技术检测肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的情况。
技术介绍
恶性肿瘤是目前全球疾病死亡的首位原因，已经成为严重威胁人类健康的一类疾病。近年来，随着高通量基因测序技术如二代测序(NGS)技术突飞猛进的发展，以肿瘤驱动基因为靶点的个体化精准医疗彻底改变了恶性肿瘤的治疗格局，越来越多的分子靶向药物不断涌现。拉罗替尼(larotrectinib)是一种由LoxoOncology和拜耳公司共同开发的新型口服小分子、高选择性原肌球蛋白受体激酶(tropomyosinreceptorkinase，TRK)抑制剂。2018年11月26日，获得美国食品与药物监督管理局(FDA)批准，用于治疗无已知耐药突变、广泛转移或局部手术治疗效果不佳的NTRK基因融合的儿童和成人实体瘤患者。这是全球第一个获批上市的与肿瘤类型无关的“广谱”抗癌药。NTRK基因融合在各个癌症类型中均有发现，常出现在先天性纤维肉瘤、先天性中胚层肾癌和分泌型乳腺癌(各90％以上)以及乳头状甲状腺癌(26％)等罕见肿瘤中，对于国内常见的肺癌和肠癌，NTRK融合的比例比较低，分别在3.5％和1.5％，在所有实体瘤中NTRK基因融合的频率约为1％。其中NTRK基因融合最常见的类型为ETV6-NTRK3。神经营养酪氨酸激酶受体3(neurotrophictyrosinekinase，receptortype3，NIRK3)定位于15q25，DNA379.612kb，含有18个外显子。编码神经营养因子3的跨膜受体，相对分子质量94.4×103，含有839个氨基酸。由胞外配体结合区，跨膜区和胞内酪氨酸激酶区组成。在神经系统的生长发育中起重要作用。除神经系统外，造血细胞，上皮细胞和多种软组织肿瘤中也有表达。NTRK3与膜表面的配体结合后，位于膜内侧的酪氨酸残基发生磷酸化并活化，具有激酶的活性。ETV6(ETSvariantgene6)定位于12p13，DNA长度约300kb，含有8个外显子。编码蛋白相对分子质量为53×103。含有452个氨基酸，是ETS(E-Twenty-six)癌基因转录因子家族中一种序列特异性的转录抑制因子。在染色体移位中，ETV6是一种常见的断裂靶点，ETV6-NTRK3基因的融合促进了肿瘤的形成。NTRK3与ETV6基因融合在一起，导致NTRK3基因编码的TRK蛋白处于持续活跃状态，引发永久性的信号级联反应，驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。在CFS(先天性纤维肉瘤)及CMN(先天性中胚层肾瘤)中，ETV6-NTRK3融合基因是通过ETV6第5外显子与NTRK3第15外显子融合在一起形成的，通过ETV6的HLH结构与NTRK3的c端结合形成融合蛋白，该融合蛋白能够不依赖配体而具有激酶活性。另外报道的还有ETV6基因第4外显子或第5外显子分别与NTRK3基因第14外显子之间的融合现象。拉罗替尼主要通过与细胞内TRKC(NTRK3编码)的ATP位点竞争性结合，进而抑制TRK的催化活性和自磷酸化，阻断下游的信号通路传导，从而发挥抗肿瘤的作用。目前融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RT-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足ETV6-NTRK3基因融合的检测，作为首选检测方法，用于指导拉罗替尼用药、评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于ETV6-NTRK3基因融合检测。
技术实现思路
本专利技术设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用实时荧光PCR技术，筛查ETV6-NTRK3融合基因。该方法快速准确，灵敏度高，特异性好，检测通量大。用于ETV6-NTRK3基因的检验试剂中包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit(TOYOBO公司)、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX(TOYOBO，QPS-101)、检测目的基因用上下游引物分别为：ETV6-ex4-F、ETV6-ex5-F、NTRK3-ex14-R，NTRK3-ex15-R探针为NTRK3-ex14-P、NTRK3-ex15-P，检测内参基因Actin用引物为Actin-F，Actin-R，探针为Actin-Probe。其中，ETV6-ex4-F:TTTCACCATTCTTCCACCCTGETV6-ex5-F:GCCTGAAGAGCACGCCATNTRK3-ex14-R:GCAGTGGGCTGGCTGAGTCNTRK3-ex15-R:AAAGGCTCCCTCACCCAGTTNTRK3-ex14-P:FAM-CTCACCACTGATGACAGCCACGGG-BHQ1NTRK3-ex15-P:VIC-TCGCTTCAGCACGATGTCTCTCCTCTTA-BHQ1Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。具体地，所述阳性对照品分别为含有ETV6-NTRK3融合基因的溶液；所述阴性对照品为不含ETV6-NTRK3融合基因组溶液。本专利技术还提供了一种检测ETV6-NTRK3融合基因的方法，包括如下步骤：1)抽提样品RNA并反转录成cDNA2)ETV6-ex4-F、ETV6-ex5-F、NTRK3-ex14-R、NTRK3-ex15-R)、检测探针(NTRK3-ex14-P、NTRK3-ex15-P)进行同管Real-timePCR扩增，同时扩增内参基因Actin作参照；3)根据Real-timePCR结果来分析样本是否有ETV6-NTRK3基因融合。步骤1)中，所述的提取方法为常规的TRIZOL法提取血液RNA，然后用TOYOBO公司的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针分别为：/nETV6-ex4-F:TTTCACCATTCTTCCACCCTG/nETV6-ex5-F:GCCTGAAGAGCACGCCAT/nNTRK3-ex14-R:GCAGTGGGCTGGCTGAGTC/nNTRK3-ex15-R:AAAGGCTCCCTCACCCAGTT/nNTRK3-ex14-P:FAM-CTCACCACTGATGACAGCCACGGG-BHQ1/nNTRK3-ex15-P:VIC-TCGCTTCAGCACGATGTCTCTCCTCTTA-BHQ1。/n

【技术特征摘要】
1.一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针分别为：
ETV6-ex4-F:TTTCACCATTCTTCCACCCTG
ETV6-ex5-F:GCCTGAAGAGCACGCCAT
NTRK3-ex14-R:GCAGTGGGCTGGCTGAGTC
NTRK3-ex15-R:AAAGGCTCCCTCACCCAGTT
NTRK3-ex14-P:FAM-CTCACCACTGATGACAGCCACGGG-BHQ1
NTRK3-ex15-P:VIC-TCGCTTCAGCACGATGTCTCTCCTCTTA-BHQ1。


2.根据权利要求1所述的一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针，其特征在于，还包括扩增Actin内参基因的引物和探针，分别为：
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。


3.一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的检测方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的总RNA并逆转录为cDNA；
(2)以步骤1中的cDNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(ETV6-ex4-F、ETV6-ex5-F、NTRK3-ex14-R、NTRK3-ex15-R)、检测探针(NTRK3-ex14-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪青，王淑一，
申请(专利权)人：长沙艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43