新的产多巴胺神经前体细胞诱导方法技术

本发明专利技术提供一种由多能干细胞制造产多巴胺神经前体细胞的方法，包括：(i)在含有选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂组成的组的试剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养的工序；(ii)使用结合于Corin的物质和/或结合于Lrtm1的物质从上述工序(i)中得到的细胞收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞的工序；以及(iii)将上述工序(ii)中得到的细胞在含有神经营养因子的培养液中进行悬浮培养的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供一种由多能干细胞制造产多巴胺神经前体细胞的方法，包括：(i)在含有选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂组成的组的试剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养的工序；(ii)使用结合于Corin的物质和/或结合于Lrtm1的物质从上述工序(i)中得到的细胞收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞的工序；以及(iii)将上述工序(ii)中得到的细胞在含有神经营养因子的培养液中进行悬浮培养的工序。【专利说明】
本专利技术涉及产多巴胺神经前体细胞的制造方法。
技术介绍
帕金森病是由于中脑黑质中产多巴胺神经细胞的脱落而发生的神经退行性疾病， 目前，世界上大约有400万人的患者。作为帕金森病的治疗，进行利用L-D0PA或多巴胺激动 剂进行的药物治疗、利用定位脑手术进行的凝固术或深部电刺激治疗和胎儿中脑移植等。 胎儿中脑移植在其供给源的组织存在伦理问题的同时感染的危险性也高。因此， 提出了使用由胚性干细胞(ES细胞）、人工多能干细胞（iPS细胞)等多能干细胞分化诱导而 得的神经细胞的治疗方法(非专利文献1)。然而，却被指出在移植分化诱导而得的神经细胞 时形成良性肿瘤的可能性和运动障碍，运动障碍的原因被认为是除了作为目的的产多巴胺 神经细胞以外的细胞，从而需要选择植活并且安全的细胞来进行移植。 因此，提出利用成为产多巴胺神经细胞或产多巴胺神经前体细胞的标记的基因对 适合移植的细胞进行筛选(专利文献1~4)，但标记的选择尚有改善的余地。此外，这些文献 中，并未对是否适合用筛选之后的细胞进行给药、或者是否可以用由该中间体细胞诱导而 得的细胞进行给药进行研究。 进而认为，为了抑制含有生物来源成分所导致的个体差异的影响、价格的大幅上 涨，产多巴胺神经细胞的制造方法是有改善的余地的。 现有技术文献 专利文献 专利文献 1:W02005/052190 专利文献 2:W02006/009241 专利文献 3:W02007/119759 专利文献 4:W02013/015457 非专利文献 非专利文献l:Wernig M，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2008,105:5856-5861
技术实现思路
本专利技术的目的是，制造适合作为帕金森病治疗剂的产多巴胺神经前体细胞。因此， 本专利技术的课题是，提供产多巴胺神经前体细胞的制造工序或制造中所需的试剂盒。 为了解决上述课题，本专利技术人等着眼于被认为是产多巴胺神经前体细胞的标记基 因的细胞表面膜蛋白Cor in和/或Lrtml，发现，通过以之为指标提取细胞、进一步继续培养 后再进行移植，即使在移植后，产多巴胺细胞也会植活，确认了通过本制造工序可获得作为 帕金森病治疗剂的产多巴胺神经前体细胞，从而完成了本专利技术。 即，本专利技术如下。 一种由多能干细胞制造产多巴胺神经前体细胞的方法，包括下面的工序： 工序（i)，在含有选自由BMP抑制剂、TG邱抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK30抑 制剂组成的组的试剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养； 工序（i i)，从上述工序（i)中得到的细胞收集Cor in和/或Lrtml阳性细胞； 工序（iii)，将上述工序（ii)中得到的细胞在含有神经营养因子的培养液中进行 悬浮培养。 根据所述的方法，细胞外基质为层粘连蛋白511或其片段。 根据所述的方法，层粘连蛋白511片段为层粘连蛋白511E8。 根据~中任一项所述的方法，上述工序(i)包括下面的工序：工序(a)，在含有BMP抑制剂和TGFP抑制剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基 质上进行贴壁培养； 工序(b)，在含有BMP抑制剂、TGFP抑制剂、SHH信号激活剂和FGF8的培养液中，将上 述工序(a)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养； 工序（c)，在含有BMP抑制剂、TG邱抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK30抑制剂的 培养液中，将上述工序(b)中得到的细胞在细胞外基质上进行贴壁培养； 工序(d)，在含有BMP抑制剂和GSK3P抑制剂的培养液中，将上述工序(c)中得到的 细胞在细胞外基质上进行贴壁培养。 根据至中任一项所述的方法，BMP抑制剂为LDN193189。 根据至中任一项所述的方法，TGFI3抑制剂为A8 3-01。 根据至中任一项所述的方法，SHH信号激活剂为嘌吗啡胺 (Purmorphamine)〇 根据至中任一项所述的方法，GSK30抑制剂为CHIR99021。 根据至中任一项所述的方法，上述神经营养因子为BDNF和⑶NF。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（iii)的工序中使用的培养液 进一步含有B27添加剂(Supplement )、抗坏血酸和二丁酰环磷酸腺苷。 根据至中任一项所述的方法，上述(i)和/或（iii)的工序中使用的培 养液进一步含有ROCK抑制剂。 根据所述的方法，ROCK抑制剂为Y-27 6 3 2。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（i)进行至少10天。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（i)进行12天至21天。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（i)进行12天至14天。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（iii)进行至少7天。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（iii)进行14天至30天。 根据至中任一项所述的方法，上述工序（iii)进行14天至16天。 根据至中任一项所述的方法，结合于Corin的物质或结合于Lrtml的 物质为结合于Corin或Lrtml的抗体或适配体。 -种产多巴胺神经前体细胞，其为通过至中任一项所述的方法得到 的。 -种帕金森病治疗剂，其含有通过至中任一项所述的方法得到的产 多巴胺神经前体细胞。 -种用于由多能干细胞制作产多巴胺神经前体细胞的试剂盒，其含有BMP抑 制剂、TGFP抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8、GSK3P抑制剂、细胞外基质和神经营养因子。 根据所述的试剂盒，其进一步含有抗Corin抗体和/或抗Lrtml抗体。 根据或所述的试剂盒，细胞外基质为层粘连蛋白511E8。 根据至中任一项所述的试剂盒，BMP抑制剂为LDN193189。 根据至中任一项所述的试剂盒，TGFP抑制剂为A83-01。 根据至中任一项所述的试剂盒，SHH信号激活剂为嘌吗啡胺。 根据至中任一项所述的试剂盒，GSK30抑制剂为CHIR99021。 根据至中任一项所述的试剂盒，神经营养因子为BDNF和⑶NF。专利技术的效果根据本专利技术，能够有效地获得对帕金森病治疗剂等有用的、适合于移植的、植活率 高的产多巴胺神经前体细胞。【附图说明】图1中显示的是产多巴胺细胞的制造方案的一例。图中，"Y"表示Y-27632，"AA"表 示抗坏血酸。 图2是表示使用MG(基质胶）、CS(CELLStart)、LMlll (层粘连蛋白111E8)或LM511 (层粘连蛋白511E8)作为包被剂来分化诱导时第12天的Tra-1-60阳性细胞的含有率、PSA-NCAM阳性细胞的含有率和Corin阳性细胞的含有率的图表。图3显示的是人iPS细胞(836B3)和分化诱导工序的细胞的相位差图像（照片）。图 像分别显示分化诱导前（左图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由多能干细胞制造产多巴胺神经前体细胞的方法，包括下面的工序：工序(i)，在含有选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号激活剂、FGF8和GSK3β抑制剂组成的组的试剂的培养液中，将多能干细胞在细胞外基质上进行贴壁培养；工序(ii)，使用结合于Corin的物质和/或结合于Lrtm1的物质从所述工序(i)中得到的细胞收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞；以及工序(iii)，将所述工序(ii)中得到的细胞在含有神经营养因子的培养液中进行悬浮培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高桥淳，土井大辅，佐俣文平，关口清俊，尾野雄一，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，卫材RD管理有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP