由多能干细胞产生的光感受器和光感受器祖细胞制造技术

本发明专利技术提供了由多能干细胞产生光感受器细胞和光感受器祖细胞的方法。此外，提供了光感受器细胞和光感受器细胞的组合物，以及其治疗用途的方法。示例性的方法可以产生光感受器细胞和/或光感受器细胞的基本纯的培养物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年3月15日提交的题为“PHOTORECEPTORSANDPHOTORECEPTORPROGENITORSPRODUCEDFROMPLURIPOTENTSTEMCELLS”的美国临时申请系列No.61/793,168的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术介绍
视网膜疾病通常由于失去了有丝分裂后的神经元细胞而导致失明。视网膜疾病包括视杆细胞或视锥细胞营养不良、视网膜变性、色素性视网膜炎、糖尿病视网膜病、黄斑退化、Leber先天性黑矇和Stargardt病。在大部分的视网膜变性中，主要是在外核层上发生细胞损失，其中所述的外核层包含视杆和视锥感光细胞。在失去有丝分裂后神经元细胞群体的情况下，需要外源新细胞替代感光细胞。光感受器细胞的潜在的替代来源包括干细胞。早期的研究使用了小鼠细胞、小鼠干细胞或视网膜祖细胞的异源群体作为用于替代失去的光感受器的可能细胞来源。这些早期的研究描述了移植由出生后第1天小鼠的视网膜得到的光感受器前体细胞(Maclarenetal.Nature444(9):203-207,2006)；由小鼠的胚胎干细胞体外生成视网膜前体细胞(Ikedaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.102(32):11331-11336,2005)；由出生后第1天小鼠的视网膜生成视网膜祖细胞(Klassenetal.Invest.Ophthal.Vis.Sci.45(11):4167-4175,2004)；在视网膜变性的RCS大鼠模型中移植骨髓间充质干细胞(Inoueetal.Exp.EyeRes.8(2):234-241,2007)；由H1人类胚胎干细胞系产生视网膜祖细胞，包括神经节细胞、无长突细胞、其中总细胞的0.01％表达S-视蛋白或视紫红质的光感受器、双极细胞和水平细胞(Lambaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.10(34):12769-12774,2006)；以及由人类成纤维细胞诱导诱导的多能干细胞(iPS)，从而产生视网膜祖细胞(Lambaetal.PLoSONE5(1):e8763.doi:10.1371/journal.pone.0008763)。这些方法均不能产生用于移植的光感受器祖细胞或光感受器细胞的均质群体。这些方法均不能产生显示体内视杆细胞或视锥细胞功能(例如通过赋予改善的视觉敏锐度而可以觉察的)的光感受器祖细胞或光感受器细胞的均质群体。供体衍生组织(由该组织可以分离出光感受器和光感受器祖细胞，例如尸体、胎儿组织和活的动物)的供应受到限制。干细胞在体外可以无限繁殖并扩展，从而为人类治疗提供非供体衍生细胞的潜在无限的来源。干细胞分化成光感受器祖细胞或光感受器的同质群体可以为视网膜疾病的移植和治疗提供充分供应的非供体衍生细胞。专利技术概述在某些实施方案中，本专利技术提供了光感受器祖细胞的基本纯的制备物，其包含：多个光感受器祖细胞；以及适用于保持光感受器祖细胞的活力的介质。在某些实施方案中，本专利技术提供了光感受器祖细胞的制备物，其包含：含有至少50％光感受器祖细胞的多个细胞；以及适用于保持光感受器祖细胞的活力的介质。在某些实施方案中，本专利技术提供了光感受器祖细胞的制备物，其包含：多个光感受器祖细胞，其基本不含多能干细胞、视网膜神经节细胞、成熟光感受器和/或无长突细胞，即，包含低于10％的这些细胞的任意一种，甚至更优选为低于5％,2％,1％,0.1％，或者甚至低于0.01％的眼部区域多能干细胞,视网膜神经节细胞,成熟光感受器和/或无长突细胞；以及适用于保持光感受器祖细胞的活力的介质。在某些实施方案中，本专利技术提供了适用于哺乳动物患者的光感受器祖细胞的药物制备物，其包含：多个光感受器祖细胞；以及用于保持光感受器祖细胞移植至哺乳动物患者中的活力的药物可接受的载体。在某些实施方案中，本专利技术提供了低温细胞制备物，其包含：至少109个光感受器祖细胞；以及与光感受器祖细胞相容并保持此类细胞在解冻后的活力的低温保藏系统。在上述制备物的优选的实施方案中，所述制备物中至少70％的细胞在免疫细胞化学方面为PAX6+和CHX10-，并且(尽管可选地)通过qPCR检测为MASH1的mRNA转录物阳性；甚至更优选的是在所述的制备物中，至少80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化学方面为PAX6+和CHX10-，并且(尽管可选地)通过qPCR检测为MASH1的mRNA转录物阳性。在某些实施方案中，通过qPCR检测，大部分的光感受器祖细胞对于Nr2e3,Trβ2,RORβ和NRO的mRNA转录物为阳性。在某些实施方案中，如通过分泌蛋白质的免疫测定或通过qPCR对mRNA转录物水平的检测，相对于视网膜神经祖细胞而言，光感受器祖细胞表达至少2,3,4,5或者甚至10倍以上的选自以下的一种或多种蛋白质：uPA,生腱蛋白-C,CXCL16,CX3CL1和几丁质酶3样蛋白1。在某些实施方案中，光感受器祖细胞具有复制能力，从而在细胞培养物中经历至少10,20,30,50或者甚至100次的群体倍增，并且在第10次、第20次、第30次、第50次或者甚至第100次倍增时低于25％的细胞发生细胞死亡、衰老或者分化成表型为非光感受器的细胞。在某些实施方案中，光感受器祖细胞的转铁蛋白和/或转铁蛋白mRNA水平比甘油醛3-磷酸脱氢酶低至少10,25,50或者甚至75％。在某些实施方案中，光感受器祖细胞在HLA基因型上是相同的，并且优选为基因组上相同的。在某些实施方案中，光感受器祖细胞的平均末端限制性片段长度(TRF)，其长于7kb,7.5kb,8kb,8.5kb,9kb,9.5kb,10kb,10.5kb,11kb,11.5kb或者甚至12kb。在某些实施方案中，相对于胎儿衍生的光感受器，光感受器祖细胞中参与下述一种或多种过程的蛋白质的含量和/或酶活性具有统计学上显著的降低：(i)细胞周期的调节和细胞老化；(ii)细胞能量和/或脂质代谢；(iii)凋亡。在某些实施方案中，相对于胎儿衍生的光感受器，光感受器祖细胞中涉及细胞骨架结构和与其有关的细胞动力学的蛋白质的含量和/或酶活性具有统计学上显著的升高。在某些实施方案中，光感受器祖细胞适用于给予人类患者。在某些实施方案中，光感受器祖细胞适用于给予非人类兽医的患者。在上述制备物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光感受器祖细胞的基本纯的制备物，其包含：多个光感受器祖细胞；以及适用于保持所述的光感受器祖细胞的活力的介质，其中通过qPCR检测，所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学方面是PAX6+和CHX10‑，并且mRNA转录物是MASH1阳性的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/793,1681.一种光感受器祖细胞的基本纯的制备物，其包含：
多个光感受器祖细胞；以及
适用于保持所述的光感受器祖细胞的活力的介质，
其中通过qPCR检测，所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞
化学方面是PAX6+和CHX10-，并且mRNA转录物是MASH1阳性的。
2.一种光感受器祖细胞的制备物，其包含：
多个细胞，其包含至少50％的光感受器祖细胞；以及
适用于保持所述光感受器祖细胞的活力的介质，
其中通过qPCR检测，所述的光感受器祖细胞在免疫细胞化学方面是
PAX6(+)和CHX10(-)，并且mRNA转录物是MASH1阳性的。
3.一种光感受器祖细胞的制备物，其包含：
多个光感受器祖细胞，其基本不含多能干细胞、视网膜神经节细胞、
成熟光感受器和/或无长突细胞；以及
适用于保持所述的光感受器祖细胞的活力的介质，
其中通过qPCR检测，所述的光感受器祖细胞在免疫细胞化学方面是
PAX6(+)和CHX10(-)，并且mRNA转录物是MASH1阳性的。
4.一种适用于哺乳动物患者的光感受器祖细胞的药物制备物，其包
含：
(a)多个光感受器祖细胞，其中通过qPCR检测，在所述制备物中
超过90％的所述细胞在免疫细胞化学方面是PAX6+和CHX10-，并且mRNA
转录物是MASH1阳性的；以及
(b)用于保持所述光感受器祖细胞移植至哺乳动物患者中的活力的
药物可接受的载体。
5.一种包含至少109个光感受器祖细胞(PRPC)的低温细胞制备物，
其包含：
(a)多个光感受器祖细胞，其中通过qPCR检测，所述制备物中超
过90％的所述细胞在免疫细胞化学方面是PAX6+和CHX10-，并且mRNA转
录物是MASH1阳性的；以及
(b)在解冻时与所述的光感受器祖细胞的活力相容的低温保藏系
统。
6.权利要求1-5中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器祖
细胞衍生自多能干细胞。
7.权利要求6所述的制备物，其中所述的多能干细胞选自人类胚胎
干细胞和诱导的多能干细胞。
8.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器祖
细胞为人类细胞。
9.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中通过qPCR检测，
大部分所述的光感受器祖细胞对于Nr2e3,Trβ2,RORβ和NRO是mRNA
转录物阳性的。
10.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器
祖细胞相对于视网膜神经祖细胞而言，表达至少2倍以上的一种或多种标志
物，该标志物选自：uPA,生腱蛋白-C,CXCL16,CX3CL1和几丁质酶3样
蛋白1，如通过对分泌蛋白质进行免疫测试或者通过qPCR测试mRNA转录物水
平所检测的。
11.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中在细胞培养物中，
所述的光感受器祖细胞具有经历至少20次群体倍增的复制能力，并且到

\t所述的第20次倍增时，少于25％的所述细胞发生细胞死亡，衰老或分化
成表型上非光感受器的细胞。
12.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器
祖细胞的转铁蛋白和/或转铁蛋白mRNA水平比甘油醛3-磷酸脱氢酶蛋白
质或mRNA水平分别低至少25％。
13.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器
祖细胞为HLA基因型一致的。
14.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器
祖细胞是基因组一致的。
15.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器
祖细胞具有长于8kb的平均末端限制性片段长度(TRF)。
16.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中相对于胎儿衍生
的光感受器，所述的光感受器祖细胞中参与以下一项或多项的蛋白质的含
量和/或酶活性具有统计学上显著的降低：(i)细胞周期的调节和细胞老
化；(ii)细胞能量和/或脂质代谢；和(iii)细胞凋亡。
17.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中相对于胎儿衍生
的光感受器而言，所述的光感受器祖细胞中参与细胞骨架结构和与其有关
的细胞动力学的蛋白质的含量和/或酶活性具有统计学上显著的升高具有
统计学意义。
18.权利要求4所述的制备物，其适用于给予人类患者。
19.权利要求4所述的制备物，其适用于给予非人类兽类患者。
20.权利要求6或7所述的制备物，其中所述的光感受器祖细胞是
由普通的多能干细胞来源分化的。
21.权利要求1所述的制备物，其中适用于保持所述光感受器祖细
胞的活力的所述介质选自培养介质、低温保藏剂以及适用于人类患者注射
的生物相容性注射介质。
22.上述权利要求中任意一项所述的制备物，其中所述的光感受器
祖细胞保持分化成视杆细胞和视锥细胞二者的可塑性。
23.上述...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·P·兰扎，卢世江，汪维，
申请(专利权)人：奥卡塔治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US