一种阴道上皮细胞分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种阴道上皮细胞分离培养方法。一种阴道上皮细胞分离培养方法，包含以下步骤：剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中，得到阴道上皮细胞。本发明专利技术首次通过含EDTA的胰酶和混合消化液对阴道组织进行二次消化分离得到阴道上皮细胞。通过优化的KSFM培养基培养阴道上皮细胞即可维持阴道上皮细胞的生长和扩增。

A method of isolation and culture of vaginal epithelial cells

【技术实现步骤摘要】
一种阴道上皮细胞分离培养方法
本专利技术属于细胞培养
,涉及一种阴道上皮细胞分离培养方法。
技术介绍
先天性无阴道或阴道发育不全、盆腔廓清术后阴道缺如或狭窄等患者常需要阴道重建。组织工程阴道种子细胞的标准化制备是功能化阴道重建的前提。但自体阴道上皮细胞存在细胞难传代，易变异，且难以标准化推广的问题，因此，需要进一步摸索该细胞的分离培养及扩增技术。目前阴道上皮细胞多采用分散酶消化过夜，剥离出上皮后，胰酶继续消化而获取。然后把分离的上皮细胞铺板，用上皮专用培养基KSFM进行培养。但是实际情况是，临床上可获取的人阴道组织很小和很碎，这样就难以进行分散酶分离上皮。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种阴道上皮细胞分离培养方法。本专利技术的另一目的是提供一种阴道上皮细胞分离培养试剂盒。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种阴道上皮细胞分离培养方法，包含以下步骤：(1)剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70～100微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的消化液A为含0.01～0.04g/100mlEDTA的0.2～0.3g/100ml胰酶溶液；(2)剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的混合消化液为含0.06～0.08g/100ml透明质酸酶、0.04～0.06g/100mlI型胶原酶和0.01～0.02g/100mlDNA酶的溶液；(3)把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，得到阴道上皮细胞，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中进行培养和扩增。作为本专利技术的一种优选实施方式，步骤(1)中消化液A为含0.02g/100mlEDTA的0.25％的胰酶溶液。作为本专利技术的一种优选实施方式，步骤(1)中所述的组织剪碎至0.5～1.5mm3。作为本专利技术的一种优选实施方式，步骤(1)中所述的混合消化液为含0.069g/100ml透明质酸酶、0.049g/100mlI型胶原酶和0.012g/100mlDNA酶的溶液。作为本专利技术的一种优选实施方式，步骤(3)中所述的培养基为改良KSFM培养基。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述的阴道上皮细胞分离培养方法还包含步骤(4)：将步骤(3)中分离获得的阴道上皮细胞在改良KSFM培养基上培养传代；所述的改良KSFM培养基为加入1～4％(v/v)FBS和4～5.5ng/mlbFGF的KSFM培养基。作为本专利技术的一种优选实施方式，步骤(4)中所述的改良KSFM培养基为加入2％FBS和5ng/mlbFGF的KSFM培养基。一种阴道上皮细胞分离培养试剂盒，包含：(1)消化液A：含0.01～0.04g/100mlEDTA的0.2g/100ml～0.3g/100ml胰酶溶液；(2)混合消化液：含0.06～0.08g/100ml透明质酸酶、0.04～0.06g/100mlI型胶原酶和0.01～0.02g/100mlDNA酶的溶液。所述的阴道上皮细胞分离培养试剂盒，优选还包含：(3)改良KSFM培养基：加入1～4％FBS和4～5.5ng/mlbFGF的KSFM培养基；优选加入2％FBS和5ng/mlbFGF的KSFM培养基。所述的阴道上皮细胞分离培养试剂盒，进一步优选由以下试剂组成：(1)消化液A：含0.01～0.04g/100mlEDTA的0.2g/100ml～0.3g/100ml胰酶溶液；(2)混合消化液：含0.06～0.08g/100ml透明质酸酶、0.04～0.06g/100mlI型胶原酶和0.01～0.02g/100mlDNA酶的溶液；(3)改良KSFM培养基：加入1～4％FBS和4～5.5ng/mlbFGF的KSFM培养基；在本专利技术的一种优选实施方式中，所述的阴道上皮细胞分离培养试剂盒由以下试剂组成：(1)消化液A为含0.02g/100mlEDTA的0.25g/100ml的胰酶溶液；(2)混合消化液：0.069g/100ml透明质酸酶、0.049g/100mlI型胶原酶和0.012g/100mlDNA酶溶液；(3)改良KSFM培养基：加入2％FBS和5ng/mlbFGF的KSFM培养基。有益效果：本专利技术首次通过含EDTA的胰酶和混合消化液对阴道组织进行二次消化分离得到阴道上皮细胞。KSFM为Gibco公司专门用于培养上皮细胞的培养基，里面含有EGF因子。但是，不同于普通的上皮细胞，阴道上皮细胞为复层鳞状上皮细胞，为终末端分化细胞，生长缓慢，且传代难。我们在采用KSFM培养基培养时，发现阴道上皮细胞增殖缓慢，传代后细胞大量死亡。但当我们添加2％FBS和5ng/mlbFGF后，即可维持阴道上皮细胞的生长和扩增(图2和图3)。在上皮细胞传至第五代后，免疫荧光进行表面标志物的鉴定，结果显示培养的细胞主要为上皮细胞(CK+)，混有极少量的间质细胞(vimentin+)，而无成纤维细胞(Hsp47+)和血管内皮细胞(CD34+)。附图说明图1不同方式分离阴道上皮细胞的光镜照片(100x)。左图为组织贴壁法获得的细胞；中图为全组织消化获得的细胞；右图为分散酶过夜分离上皮组织后，胰酶消化获得的细胞。图2培养基优化培养阴道上皮细胞光镜照片(100x)。左图为普通培养基培养的阴道上皮细胞；中图为KSFM培养基培养的阴道上皮细胞；右图为添加bFGF及FBS的优化KSFM培养基培养的阴道上皮细胞。图3全组织消化获得的阴道上皮细胞(100x)可在KSFM+FBS+bFGF培养基中扩增和传代。左中右分别表示P1代、P3代及P5代的阴道上皮细胞。图4对P5代阴道上皮细胞鉴定。上皮细胞纯度很高。CK：上皮细胞标志；Vimentin：间质细胞标志；HSP47：成纤维细胞标志；CD34：血管内皮细胞标志具体实施方式实施例1剪碎组织，先用含0.02g/100mlEDTA的0.25g/100ml％的胰酶溶液消化1h，然后过70微米细胞筛，收集细胞。剩余的组织继续加入透明质酸酶(Sigma,No.H3506,0.069g/100ml)、I型胶原酶(Sigma,No.C0130,0.049g/100ml)和DNA酶(Roche,No.139-134P11,0.012g/100ml)混合液消化30min，然后过70微米细胞筛，收集细胞。把两次收集的细胞离心(800g)，用培养基清洗两遍后，铺于Matrigel(BD，356234)预包被的细胞培养板中，可得到纯度较高的上皮细胞。对比例1把阴道组织块剪至1-2mm3。剪碎的组织块在Matrigel预包被的细胞培养板底均匀分布，置于孵箱中孵育30－60min后，小心加入培养液，不要剧烈晃动。次日，用500ulKSFM+FBS+bFGF培养基换液(保证最下面的组织块有液体即可)。对比例2把阴道组织块剪至长宽各0.5cm左本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于包含以下步骤：/n(1)剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70～100微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的消化液A为含0.01～0.04g/100ml EDTA的0.2～0.3g/100ml胰酶溶液；/n(2)剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70～100微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的混合消化液为含0.06～0.08g/100ml透明质酸酶、0.04～0.06g/100ml I型胶原酶和0.01～0.02g/100ml DNA酶的溶液；/n(3)把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，得到阴道上皮细胞，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中进行培养和扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)剪碎组织，先用消化液A消化，然后过70～100微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的消化液A为含0.01～0.04g/100mlEDTA的0.2～0.3g/100ml胰酶溶液；
(2)剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70～100微米细胞筛，收集细胞；其中，所述的混合消化液为含0.06～0.08g/100ml透明质酸酶、0.04～0.06g/100mlI型胶原酶和0.01～0.02g/100mlDNA酶的溶液；
(3)把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，得到阴道上皮细胞，铺于Matrigel预包被的细胞培养板中进行培养和扩增。


2.根据权利要求1所述的阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于步骤(1)中消化液A为含0.02g/100mlEDTA的0.25％的胰酶溶液。


3.根据权利要求1所述的阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于步骤(1)中所述的组织剪碎至0.5～1.5mm3。


4.根据权利要求1所述的阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于步骤(1)中所述的混合消化液为含0.069g/100ml透明质酸酶、0.049g/100mlI型胶原酶和0.012g/100mlDNA酶的溶液。


5.根据权利要求1所述的阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养基为改良KSFM培养基。


6.根据权利要求1～5中任一项所述的阴道上皮细胞分离培养方法，其特征在于还包含步骤(4)：将步骤(3)中分离获得的阴道上皮细胞在改良KSFM培养基上培养传代；所述的改良KSFM培养基为加入1～4％FBS和4～5.5ng/mlbFGF的KSFM培养基。

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【专利技术属性】
技术研发人员：赵光锋，胡娅莉，戴建武，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32