一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法技术

本发明专利技术涉及一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，属于细胞培养方法领域，具体步骤：（1）分离提取猪乳腺原代上皮细胞，选取10代之前的细胞；（2）用胰蛋白酶消化成单细胞后离心弃去上清液，用普通培养基重悬，调整细胞浓度至1×10

A three-dimensional continuous culture method of porcine mammary epithelial cells

【技术实现步骤摘要】
一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法
本专利技术涉及细胞培养方法领域，具体涉及一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法。
技术介绍
乳腺上皮细胞是组成乳腺的主要细胞，具有特殊的乳汁分泌功能，乳汁的许多成分只有乳腺上皮细胞才能合成。乳腺细胞的研究始于20世纪70年代，通过有效的细胞培养方法在细胞水平上培养原代乳腺上皮细胞，并进行传代来研究乳腺的生长、发育及泌乳细胞或分子生物学机制等已成为热点。目前以人、小鼠、牛的乳腺上皮细胞为模型进行的研究颇为丰富，但对猪乳腺上皮细胞的研究少有报道。细胞技术作为医学生物技术中最核心、最基础的技术，已成为当今医学科研工作的必备技能，广泛应用于生命科学的众多领域。传统细胞培养通常为细胞生长在单层的玻璃或塑料平面上，具有较好的伸展性，但不能充分真实模拟体内生长模式，最终影响细胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表达等细胞过程。与单层细胞培养系统相比，三维细胞培养系统能更准确地反映细胞在组织中的实际微环境。三维细胞培养方法是将细胞放置在模仿体内细胞环境的三维培养载体内进行体外培养，细胞在三维载体的立体空间结构中生长，构成三维的细胞载体复合物。相较于传统的单层细胞培养，三维细胞培养方法能更好地模拟体内条件，能更紧密地模仿复杂的细胞组织间相互作用以及在体内的微环境，为细胞的最佳生长、分化提供了一个合适的微环境，并有在体外创造组织样结构的能力。通过允许单个细胞维持其正常的三维形状，有助于细胞与相邻细胞间形成复杂的相互作用和信号接收及发送，为不同类型的细胞培养创造一个更自然的生长环境。目前结合猪乳腺上皮细胞和三维细胞培养方法的研究还鲜有报道，为改善传统单层细胞培养方法在乳腺上皮细胞培养中存在的缺陷，提供一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，对于猪乳腺上皮细胞的研究具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，该方法使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，所创建的细胞生长环境，最大程度地模拟体内环境，同时可以持续培养。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，包括以下步骤：（1）分离提取猪乳腺原代上皮细胞10代之前的细胞进行实验；（2）用胰蛋白酶消化猪乳腺上皮细胞成单细胞后，1000rpm离心4~6min，弃去上清液，加入1mL普通培养基重悬后，调整细胞浓度至1×106~5×106cells/mL，600~800rpm离心4~6min后，弃去上清液加入1mL实验用Matrigel重悬，混匀冰上备用；（3）使用200μL枪头吸取步骤（2）所得的悬液，以20~40μL/每滴的量滴入六孔板，每孔7~8滴，滴完后倒扣置于37℃二氧化碳培养箱中孵育30~40min使其凝固；（4）在六孔板每孔加入2mL三维培养基，持续培养12~16天，根据培养基颜色每2~3天更换一次三维培养基；（5）去除培养基，用D-PBS缓冲液洗三遍后，每孔加入2mL胰蛋白酶，使用1mL枪头吹散，37℃培养，每隔2~4min吹散混匀，直至成为单细胞，三维培养基中和消化后，4℃600~1000rpm离心4~6min后，去除上清液，按照步骤（2）~（4）进行传代，并对三维培养细胞RNA和蛋白进行提取检测；三维细胞RNA提取方法：去除培养基，用D-PBS洗3遍后直接加入Trizol裂解收集，-100~-60℃保存；使用Trizol法提取RNA即可；三维培养细胞蛋白的提取方法：去除培养基，用预冷的D-PBS洗3遍后，六孔板每孔加入2mL胰蛋白酶，使用1mL枪头吹散，放入37℃二氧化碳培养箱中使其完全消化，三维培养基中和消化后，4℃800~1200rpm离心4~6min后，去除上清液，加入1mLD-PBS重悬后，4℃800~1200rpm离心4~6min去除上清液，加入蛋白裂解液，裂解蛋白收集样本，-100~-60℃保存；所述的三维培养基的配制：1mLAdvancedDMEM/F12培养基：40~60%L-WRNcells培养上清液（富含Wnt3α，R-spondins，Noggin蛋白因子的条件性培养基），8~12%胎牛血清，1~2%青霉素*链霉素，8~12μMY27632（ROCK抑制剂），8~12μMSB202190（P38抑制剂）；8~12ng/mL上皮生长因子；0.4~0.6μg/mL氢化可的松；1*B-27；1*谷氨酰胺；0.01~0.02%ITS（Insulin-胰岛素、HumanTransferrin-人转铁蛋白、SelenousAcid-亚硒酸）；1*两性霉素B&庆大霉素；25μM支原体去除剂Plasmocin；1.00~1.50mMN-乙酰半胱氨酸，所组成的三维培养基用0.20μM过滤器过滤。Matrigel的配制：50~60%的Matrigel原液+40~50%的三维培养基，-25~-15℃保存一个月，处理前2~3小时放入3~5℃水上或冰上预热。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的技术能更好地为细胞的最佳生长、分化提供了一个合适的微环境，使得基质和细胞充分接触，更加符合体内微环境，且操作更为省时简便，同时可以持续培养。附图说明图1为单层和三维培养方法下猪乳腺上皮细胞生长5天的效果对比图；图2为三维培养方法下猪乳腺上皮细胞生长1、5、9、13天的效果图。具体实施方式在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面结合附图和具体的实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些说明仅用于说明本专利技术，并不限制本专利技术的保护范围。Matrigel的配制：50~60%Matrigel的原液+40~50%的三维培养基，-25~-15℃保存一个月，处理前2~3小时放入3~5℃水上或冰上预热。三维培养基的配制1mLAdvancedDMEM/F12培养基：40~60%L-WRNcells培养上清液（富含Wnt3α，R-spondins，Noggin蛋白因子的条件性培养基），8~12%胎牛血清，1~2%青霉素*链霉素，8~12μMY27632（ROCK抑制剂），8~12μMSB202190（P38抑制剂）；8~12ng/mL上皮生长因子；0.4~0.6μg/mL氢化可的松；1*B-27；1*谷氨酰胺；0.01~0.02%ITS（Insulin-胰岛素、HumanTransferrin-人转铁蛋白、SelenousAcid-亚硒酸）；1*两性霉素B&庆大霉素；25μM支原体去除剂Plasmocin；1.00~1.50mMN-乙酰半胱氨酸，培养基用0.20μM过滤器过滤，所述的百分比均为体积百分比。实施例1一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，包括以下步骤：（1）分离提取猪乳腺原代上皮细胞10代之前的细胞；（2）用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）分离提取猪乳腺原代上皮细胞10代之前的细胞进行实验；/n（2）用胰蛋白酶消化猪乳腺上皮细胞成单细胞后，1000rpm离心4~6min，弃去上清液，加入1mL普通培养基重悬后，调整细胞浓度至1×10

【技术特征摘要】
1.一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）分离提取猪乳腺原代上皮细胞10代之前的细胞进行实验；
（2）用胰蛋白酶消化猪乳腺上皮细胞成单细胞后，1000rpm离心4~6min，弃去上清液，加入1mL普通培养基重悬后，调整细胞浓度至1×106~5×106cells/mL，600~800rpm离心4~6min后，弃去上清液加入1mL实验用Matrigel重悬，混匀备用；
（3）使用200μL枪头吸取步骤（2）所得的悬液，以20~40μL/每滴的量滴入六孔板，每孔7~8滴，滴完后倒扣置于37℃二氧化碳培养箱中孵育30~40min使其凝固；
（4）在六孔板每孔加入2mL三维培养基，持续培养12~16天，根据培养基颜色每2~3天更换一次三维培养基；
（5）去除培养基，用D-PBS缓冲液洗三遍后，每孔加入2mL胰蛋白酶，使用1mL枪头吹散，37℃培养，每隔2~4min吹散混匀，直至成为单细胞，三维培养基中和消化后，4℃600~1000rpm离心4~6min后，去除上清液，按照步骤（2）~（4）进行传代，并对三维培养细胞RNA和蛋白进行提取检测。


2.根据权利要求1所述的一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法，其特征在于：步骤（2）所述的Matrigel的配制：50~60%的Matrigel原液+40~50%的三维培养基，-25~-15℃保存一个月，处理前2~3小时放入3~5℃水上或者冰上预热。


3.根据权利要求1所述的一种猪乳腺上皮细胞三维持续培养方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖昊，查翠芳，王丽，杨雪芬，蒋宗勇，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44