一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其包括以下步骤：对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块。本发明专利技术实施例的方法用组织芯片法分离福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixed paraffin embedding，FFPE)的组织，操作相对简便，且后续DNA或RNA的提取易于操作，提取的RNA不易污染、降解，质量和浓度都较高，而且成本低。从细胞成分不同的组织切片中分离高度纯化的细胞群，解决了细胞异质性问题，从而提高了从FFPE的组织中提取DNA或RNA的质量。

A method for paraffin embedded tissue separation and cell detection

【技术实现步骤摘要】
一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法
本专利技术实施例涉及生物检测
，具体涉及一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法。
技术介绍
分子检测技术是分子诊断的前提和基础，分子检测技术主要包括DNA测序、荧光原位杂交、实时定量PCR、片段分析等，这些检测技术主要围绕DNA、RNA水平开展。新鲜冰冻组织的DNA、RNA保存较为完整，降解少，故从新鲜冰冻组织提取的DNA、RNA检测数据较为可信，因此目前常用新鲜冰冻组织开展研究，但新鲜冰冻组织保存成本高，组织收集困难，在一定程度上限制了其应用，但福尔马林固定石蜡包埋(Formalinfixedparaffinembedding，FFPE)的组织容易获得，且制作成本低廉、容易保存，但组织经福尔马林固定石蜡包埋后极易引起DNA、RNA降解，而且一张切片上除了肿瘤细胞还存在其他的坏死组织、结缔组织、免疫细胞、血管等，直接提取DNA或RNA进行相关分子的检测十分不严谨。激光捕获显微切割(Lasercapturemicrodissection，LCM)是一种能够准确识别并从复杂的异构细胞群中分离同质细胞群的技术手法，ArcturusXTTM系统LCM是现今世界上唯一将LCM和紫外、红外双激光融为一体的显微切割仪器。LCM已经被用于有效的分离各种类型细胞并获取DNA、RNA、蛋白质等。LCM适用组织类型与获取样本种类的多样性使其在科研中起到的作用越发关键。LCM最大优势为能准确分离纯化目的细胞，甚至可通过免疫组化或免疫荧光将特异性细胞标记，收集到的细胞成分能够达到绝对单一。但LCM分离-RNA提取前进行的HE染色过程极易引起RNA降解，且应用的过程中，其成本较高。因此，如何精确的获取目的细胞变得尤为重要。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，以解决现有技术中检测通量低，检测成本高以及无法获得过度纯化细胞以及提取的DNA或RNA的质量低的问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其包括以下步骤：对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块；使用具有孔径的针，将多个所述相关病例的包埋蜡块的目的细胞区穿在同一蜡块的不同位置上，并在所述蜡块上做好标记，形成了组织芯片，并对其进行HE染色，显微镜下确定是否为目的细胞区域的组织芯片。优选的，所述方法还包括：用所述组织芯片进行原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR或原位RT-PCR。优选的，所述针的直径为1mm。优选的，所述HE切片标记的目的细胞区域的数量为1-4个。优选的，所述方法还包括：用所述组织芯片的蜡块提取目的细胞的RNA，以及通过mRNA反转录获得cDNA。优选的，所述RNA溶液浓度和纯度紫外分光光度计波长260nm和280nm处吸光度的比值确定。优选的，将所述cDNA进行荧光定量PCR，检测所述目的细胞的基因表达量。优选的，所述cDNA的添加量不要超过PCR反应体系体积的10％。本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术实施例的方法，将多个病例的目标细胞集中到同一蜡块上，可以同时对细胞进行检测，提高检测通量，例如，在做免疫组化的过程中可以节省抗体的使用，同时也减少了蜡块的使用损耗。本专利技术实施例的方法用组织芯片法分离FFPE的组织，操作相对简便，且后续DNA或RNA的提取易于操作，提取的RNA不易污染、降解，质量和浓度都较高，而且成本低。从细胞成分不同的组织切片中分离高度纯化的细胞群，解决了细胞异质性问题，从而提高了从FFPE的组织中提取DNA或RNA的质量。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11、试验材料及方法收集自1980-2012年期间石河子大学医学院第一附属医院病理科滑膜肉瘤病例12例(临床资料详见表1)，所有切片均经过两位以上资深病理医师阅片，根据2013年WHO软组织最新分类标准和Enzinger&Weiss软组织肿瘤(第五版)进行分类及分级，所有病例均进行免疫组化及一步法RT-PCR技术检测SYT-SSX融合基因进行最终确诊。表112例滑膜肉瘤临床资料一览表注:-F‖为女性，-M‖为男性；BSS：双相型滑膜肉瘤，MFSS：单相型滑膜肉瘤2、组织芯片法分离滑膜肉瘤上皮区与梭形区1)由2位以上资深病理医师选取分化较好的双相型滑膜肉瘤病例，在HE切片上用记号笔标记出每例的梭形细胞区(相等于目的细胞区1)和上皮样细胞区(相当于目的细胞区2)，其中，每例每种细胞区标记1-4个区域。2)仔细用相应的蜡块对比HE切片上标记的位置，准确定位组织蜡块上对应的位置并作标记。3)整理核对所有被标记的供体组织蜡块。4)使用直径1mm孔径的针，将每一例的梭形细胞区穿在同一个蜡块上，上皮细胞区穿在另一个蜡块上，在蜡块上做好标记。5)用制好的蜡块切片，形成组织芯片，染HE，显微镜下观察，以确定新制组织芯片是目的细胞区域。3、组织芯片提取RNA(Trizol法)1)将组织芯片的蜡块放在切片机上，刀片用酒精擦拭。2)4μm每张进行连续切割，其中2孔芯片(相当于每例每种细胞区标记2个区域)切35张，3孔芯片(相当于每例每种细胞区标记3个区域)切25张，4孔芯片(相当于每例每种细胞区标记4个区域)切20张，分别装入2ml的无酶EP管内，掌上离心机离心1min，以使组织入管底；3)加入1.5ml二甲苯，上下摇匀5min，55℃水浴，10min；4)23℃下离心，10000rpm，6min；5)弃上清，加二甲苯1.5ml，上下摇匀5min，55℃水浴，10min；6)23℃下离心，10000rpm，6min；7)弃上清，加无水乙醇1.5ml，上下摇匀10min；8)4℃离心13000rpm，10min，弃上清；9)重复7.8两次；10)室温干燥15min；11)加lysisbuffer(细胞裂解液)200μl，轻轻混匀，加蛋白酶K40μl；12)混匀后封口膜封口，置于55℃水浴摇床过夜；13)次日，液体清亮，95℃5min以灭火蛋白酶K，9000rpm，4℃离心11min，取上清，记录液体体积。14)加Trizol1ml，上下颠倒轻轻混匀5分钟后置冰上静置30min；15)加入等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：/n对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；/n对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块；/n使用具有孔径的针，将多个所述相关病例的包埋蜡块的目的细胞区穿在同一蜡块的不同位置上，并在所述蜡块上做好标记，形成了组织芯片，并对其进行HE染色，显微镜下确定是否为目的细胞区域的组织芯片。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
对同一病种多个相关病例的包埋蜡块组织进行HE染色及组织学观察，在每个所述HE切片上确认并标记目的细胞区；
对比所述HE切片上标记的细胞区，准确标记定位所述包埋蜡块上相对应的目的细胞区位置，核对所有被标记的所述包埋蜡块；
使用具有孔径的针，将多个所述相关病例的包埋蜡块的目的细胞区穿在同一蜡块的不同位置上，并在所述蜡块上做好标记，形成了组织芯片，并对其进行HE染色，显微镜下确定是否为目的细胞区域的组织芯片。


2.如权利要求1所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述方法还包括：用所述组织芯片进行原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR或原位RT-PCR。


3.如权利要求1所述的用于石蜡包埋组织分离检测细胞的方法，其特征在于，
所述针的直径为1mm。


4....

【专利技术属性】
技术研发人员：齐妍，董双双，王宁，
申请(专利权)人：齐妍，
类型：发明
国别省市：新疆;65