基于背侧化信号转导物质或腹侧化信号转导物质的增加视锥细胞或视杆细胞的方法技术

本发明专利技术的课题在于提供富含视锥前体细胞和/或视锥细胞的视网膜组织、富含视杆细胞前体细胞和/或视杆细胞的视网膜组织、及它们的制备方法等。使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞和视细胞中的视锥细胞前体细胞和视锥细胞的比例增加的方法，其包括将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的阶段的视网膜组织在i)含有抑制腹侧标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基中培养的工序，或，使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞和视细胞中的视杆细胞前体细胞和视杆细胞的比例增加的方法，其包括将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的阶段的视网膜组织在ii)促进腹侧标记的表达的程度的浓度的腹侧化信号转导物质的存在下培养的工序。

Methods of increasing cone cells or rod cells based on dorsal or ventral signal transducers

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于背侧化信号转导物质或腹侧化信号转导物质的增加视锥细胞或视杆细胞的方法
本专利技术涉及富含视锥细胞或视杆细胞的视网膜组织、及它们的制备方法。
技术介绍
关于小鼠、大鼠、人或鸡的视网膜组织，据说均根据背侧化信号和腹侧化信号进行区域决定，但根据动物种类不同，各自具有独特的结构。例如，在人和鸡的视网膜中，与小鼠、大鼠不同，在眼底(或中心视网膜：centralretina)存在称为黄斑部的视锥细胞(视锥)的比例高的区域，而在其中心部仅存在视锥细胞(无视杆细胞区)，特别是在人视网膜组织中的黄斑部中，越接近中心部，LM视锥细胞的含量越高，随着越向周围，相反地S视锥细胞的比例越高。另外，在黄斑部的外侧存在包含S视锥细胞和视杆细胞的区域，视杆细胞密集在黄斑部的外缘部。已知在鸡的视网膜组织中，切除鸡胚的处于眼泡期的视网膜组织的整个背侧化区域，由此无视杆细胞区消失；以及通过腹侧化信号的过度表达，由此无视杆细胞区消失，启示了无视杆细胞区由背侧化区域的参与而形成(非专利文献1)。另一方面，已知数种从ES细胞等多潜能干细胞向视网膜组织进行分化诱导的培养法(专利文献1～5)。然而，在人或鸡的视网膜组织中，背侧化区域如何参与无视杆细胞区的形成尚属未知。特别是制备富含视锥细胞(LM视锥细胞和/或S视锥细胞)或视杆细胞的视网膜组织的方法是完全未知的。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2009/148170号专利文献2：国际公开第2011/055855号专利文献3：国际公开第2013/077425号专利文献4：国际公开第2013/065763号专利文献5：国际公开第2015/025967号非专利文献非专利文献1：JNeurosci.25(11)：2823-2831(2005)
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术要解决的问题在于提供富含视锥细胞或视杆细胞的视网膜组织、及它们的制备方法。解决问题的方法本专利技术者等为解决上述问题进行了反复研究后，发现通过将包含视网膜祖细胞或神经视网膜祖细胞、且处于神经节细胞未出现的分化阶段的视网膜组织，即发育早期阶段(InitialDevelopmentalStage)的视网膜组织在抑制腹侧标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的存在下培养、使其成熟，可使视细胞中包含的视锥细胞的比例与在前述背侧化信号转导物质不存在下培养时相比增加。另外，发现通过将发育早期阶段的视网膜组织在腹侧化信号转导物质的存在下培养而使其成熟，可使视细胞中包含的视杆细胞的比例与在前述腹侧化信号转导物质不存在下培养时相比增加，从而完成本专利技术。即，本专利技术涉及以下内容：[1]一种使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞(感光细胞前体)和视细胞(感光细胞)中的视锥细胞前体细胞和视锥细胞的比例增加的方法，其包括以下工序：将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的阶段的视网膜组织在包含抑制腹侧标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基中培养；[2]根据上述[1]所述的方法，其中，视锥细胞前体细胞和视锥细胞为NRL阴性的细胞，所述NRL阴性的细胞为CRX阳性且RXR-γ阳性，或CRX阳性且TRβ2阳性；[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其中，腹侧标记为ALDH1A3和/或COUP-TFI；[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为不诱导最背侧的标记的表达的程度；[5]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为促进背侧标记的表达的程度；[6]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为不诱导最背侧的标记的表达的程度并且促进除其以外的背侧标记的表达的程度；[7]根据上述[5]或[6]所述的方法，其中，背侧标记为CYP26A1和/或CYP26C1；[8]根据上述[4]或[6]所述的方法，其中，最背侧的标记为COUP-TFII；[9]根据上述[5]或[6]所述的方法，其中，背侧标记为ALDH1A1；[10]根据上述[9]所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为诱导1.35nM的BMP4促进的ALDH1A1的表达量的0.1％以上且30％以下的ALDH1A1的表达的程度；[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织包含睫状边缘区样结构体；[12]根据上述[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织包含能分化为视细胞和神经节细胞的细胞；[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织源自多潜能干细胞；[14]根据上述[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织源自由成体组织得到的神经上皮细胞；[15]根据上述[1]～[14]中任一项所述的方法，其特征在于，发育早期阶段的视网膜组织包含PAX6阳性且RX阳性的细胞；[16]根据上述[1]～[15]中任一项所述的方法，其特征在于，发育早期阶段的视网膜组织包含PAX6阳性、RX阳性且CHX10阳性的细胞；[17]根据上述[1]～[16]中任一项所述的方法，其中，在背侧化信号转导物质的存在下培养的工序持续4天～170天；[18]根据上述[17]所述的方法，其中，在背侧化信号转导物质的存在下培养的工序持续到在背侧化信号转导物质不存在下培养时出现视杆细胞前体细胞的时期；[19]根据上述[1]～[18]中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质为能诱导相当于0.01nM～0.90nM的BMP4的BMP信号的BMP信号转导通路作用物质或Wnt信号转导通路作用物质、或者SHH信号转导通路抑制物质；[20]根据上述[1]～[19]中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质为BMP4；[21]根据上述[20]所述的方法，其中，BMP4的浓度为0.05nM～0.45nM；[22]根据上述[1]～[19]中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质为环巴胺-KAAD；[23]根据上述[22]所述的方法，其中，环巴胺-KAAD的浓度为0.01μM～5μM；[24]根据上述[23]所述的方法，其中，环巴胺-KAAD的浓度为0.2μM～1μM；[25]根据上述[1]～[24]中任一项所述的方法，其在不含9-顺式视黄酸的培养基中实施；[26]一种视网膜组织，其包含通过上述[1]～[25]中任一项所述的方法得到的富含视锥细胞前体细胞的视细胞前体细胞和/或富含视锥细胞的视细胞；[27]一种视网膜组织，其包含富含视锥细胞前体细胞的视细胞前体细胞和/或富含视锥细胞的视细胞，其中，所述视细胞前体细胞和视细胞中的、视锥细胞前体细胞和视锥细胞的细胞数与视杆细胞前体细胞和视杆细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞(感光细胞前体)和视细胞(感光细胞)中的视锥细胞前体细胞和视锥细胞的比例增加的方法，其包括将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的阶段的视网膜组织在包含抑制腹侧标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基中培养的工序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170914 JP 2017-1771871.一种使视网膜组织中包含的视细胞前体细胞(感光细胞前体)和视细胞(感光细胞)中的视锥细胞前体细胞和视锥细胞的比例增加的方法，其包括将从发育早期阶段到视锥细胞前体细胞的出现率达到最大的阶段的视网膜组织在包含抑制腹侧标记的表达的程度的浓度的背侧化信号转导物质的培养基中培养的工序。


2.根据权利要求1中所述的方法，其中，视锥细胞前体细胞和视锥细胞为NRL阴性的细胞，并且为CRX阳性且RXR-γ阳性，或CRX阳性且TRβ2阳性的NRL阴性的细胞。


3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，腹侧标记为ALDH1A3和/或COUP-TFI。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为不诱导最背侧的标记的表达的程度。


5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为促进背侧标记的表达的程度。


6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为不诱导最背侧的标记的表达的程度并且促进除其以外的背侧标记的表达的程度。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，背侧标记为CYP26A1和/或CYP26C1。


8.根据权利要求4或6所述的方法，其中，最背侧的标记为COUP-TFII。


9.根据权利要求5或6所述的方法，其中，背侧标记为ALDH1A1。


10.根据权利要求9所述的方法，其中，背侧化信号转导物质的浓度为诱导1.35nM的BMP4促进的ALDH1A1的表达量的0.1％以上且30％以下的ALDH1A1的表达的程度。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织包含睫状边缘区样结构体。


12.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织包含能分化为视细胞和神经节细胞的细胞。


13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织源自多潜能干细胞。


14.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织源自由成体组织得到的神经上皮细胞。


15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其特征在于，发育早期阶段的视网膜组织包含PAX6阳性且RX阳性的细胞。


16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，发育早期阶段的视网膜组织包含PAX6阳性、RX阳性且CHX10阳性的细胞。


17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，在背侧化信号转导物质的存在下培养的工序持续4天～170天。


18.根据权利要求17中所述的方法，其中，在背侧化信号转导物质的存在下培养的工序持续到在背侧化信号转导物质不存在下培养时出现视杆细胞前体细胞的时期。


19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质为能诱导相当于0.01nM～0.90nM的BMP4的BMP信号的BMP信号转导通路作用物质或Wnt信号转导通路作用物质、或SHH信号转导通路抑制物质。


20.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质为BMP4。


21.根据权利要求20所述的方法，其中，BMP4的浓度为0.05nM～0.45nM。


22.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，背侧化信号转导物质为环巴胺-KAAD。


23.根据权利要求22所述的方法，其中，环巴胺-KAAD的浓度为0.01μM～5μM。


24.根据权利要求23所述的方法，其中，环巴胺-KAAD的浓度为0.2μM～1μM。


25.根据权利要求1～24中任一项所述的方法，其在不含9-顺式视黄酸的培养基中实施。


26.一种视网膜组织，其包含通过权利要求1～25中任一项所述的方法得到的富含视锥细胞前体细胞的视细胞前体细胞和/或富含视锥细胞的视细胞。


27.一种视网膜组织，其包含富含视锥细胞前体细胞的视细胞前体细胞和/或富含视锥细胞的视细胞，其中，视细胞前体细胞和视细胞中的视锥细胞前体细胞和视锥细胞的细胞数与视杆细胞前体细胞和视杆细胞的细胞数相比为2倍以上，优选为4倍以上，且具有神经节细胞。


28.根据权利要求26或27中所述的视网膜组织，其中，全部视细胞前体细胞和全部视细胞所包含的视锥细胞前体细胞和视锥细胞的细胞数为70％以上，优选为80％以上。


29.一种视网膜组织，其能通过培养成熟为权利要求26或27所述的视网膜组织。


30.根据权利要求26～29中任一项所述的视网膜组织，其中，视网膜组织的层结构的50％以上形成连续上皮结构。


31.根据权利要求30中所述的视网膜组织，其中，视网膜组织的长轴方向的直径为0.6mm以上。


32.医药组合物，其用于向视网膜疾病患者的需要移植的视网膜组织移植，其包含从权利要求26～31中任一项所述的视网膜组织切出的视网膜组织片。


33.根据权利要求32所述的医药组合物，其中，需要移植的视网膜组织为包含无视杆细胞区的区域的组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：糠谷大树，永乐元次，木濑结子，大西晓士，高桥政代，笹井芳树，
申请(专利权)人：国立研究开发法人理化学研究所，大日本住友制药株式会社，住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP