一种成纤维细胞培养方法技术

本发明专利技术公开一种成纤维细胞培养方法及其培养基,及由此方法获得成纤维细胞。本申请采用含有干细胞培养基的培养上清和生长培养基共同培养的方法培养成纤维细胞，不仅提高成纤维细胞的活性，促进成纤维细胞分泌胶原蛋白，而且缩短了成纤维细胞抗衰除皱时间，对于迫切需求改善的治疗者缩短了等待时间，降低了治疗的经济成本和时间成本。

A method of fibroblast culture

【技术实现步骤摘要】
一种成纤维细胞培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种细胞培养基及其应用，更具体涉及一种成纤维细胞培养基及其培养方法及由此方法获得成纤维细胞。
技术介绍
成纤维细胞，也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，属于终末分化细胞，这种细胞会制造胶原蛋白等蛋白质。成纤维细胞数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清，具有突起。其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同。处于成熟期或称静止状态的纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。laViv自体成纤维细胞注射是美国Fibrocell公司开发的自体成纤维细胞移植美容技术，2011年6月22日获美国食品药品管理局(FDA)批准用于改善成人中重度鼻唇沟皱纹。laViv是一种个体化美学细胞疗法，其专利技术是提取患者本人生成胶原的皮肤细胞--成纤维细胞并进行增殖。laViv需要连续注射3次，相邻2次治疗的间隔时间为3～6周。其治疗流程大致为：(1)、从患者耳后取约3～4平方毫米的皮肤，分离出真皮内的成纤维细胞，送至厂商工厂(FibrocellcGMP)；(2)、在工厂内，将样本纤维原细胞培养增殖大量新细胞，冷冻储藏，供多次注射治疗使用；(3)、治疗时，将培养增殖细胞注射入患者自体皮肤，从而达到增加局部纤维原细胞数量、促进胶原形成、促进自身再生修复过程的功效。优势：自体细胞和患者组织相容，成功解决了排斥问题，该细胞可以存活于体内，在注射后即刻及较长时间段内都具有对皱纹或皮肤凹陷的治疗效果。没有证据表明细胞在注射后会被机体吸收或损失，随着时间的推移，除皱的效果更加显著。laViv自体成纤维细胞注射技术自1995年开始，已经在英国开展6000多个临床病例，美国开展2000多个临床病例，最长随访病例长达6年。患者满意度高，除注射部位不良反应外，未出现严重不良反应。不良反应：在临床试验中，最常见的不良反应是注射部位发红、瘀伤、肿胀、疼痛、出血、水肿、结节、丘疹、刺激、皮炎和瘙痒。注射部位反应在严重程度上多数属轻度至中度，并在1周内消退。
技术实现思路
为解决当前人体成纤维细胞在美容抗衰领域中存在的laviv细胞回输见效慢，时间成本和经济成本高，现提供一种细胞培养基及其应用、及成纤维细胞培养方法，不仅提高了成纤维细胞的活性，促进成纤维细胞分泌胶原蛋白，而且缩短了成纤维细胞抗衰除皱时间，对于迫切需求改善的治疗者缩短了等待时间，降低了治疗的经济成本和时间成本。为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：本专利技术提供一种细胞培养基，该培养基包括以下培养基成分：生长培养基和干细胞培养基的培养上清。其中上述生长培养基为：以高葡萄糖DMEM为基础培养基，添加0.5-15％(V/V)胎牛血清和0.05-1％浓度为1％的抗生素。其中所述的抗生素为细胞培养领域常规用抗生素，如链霉素、青霉素、庆大霉素等。其中上述的干细胞培养基的培养上清是指干细胞在培养过程中使用的培养基，在干细胞培养过程中干细胞换液或者传代中而吸取丢弃的已培养干细胞的培养液。将上述吸取丢弃的已培养干细胞的培养液经离心处理后即为本申请中所述的干细胞培养基的培养上清。其中上述细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为0.1-100:0.1-30。更进一步的，上述细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为0.1-50:0.1-10。更进一步的，上述细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为1-20:5-10。其中上述的干细胞可以为按功能划分的全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞或者专一性干细胞；也可以是按发育过程出现先后和分步分类的各种干细胞，如胚胎干细胞、成体干细胞等。其中上述的干细胞，优选为脐带间充质干细胞(UCMSC)。本申请的另一个目的在于提供上述细胞培养基的应用，该细胞培养基应用于培养动物细胞，特别是人体成纤维细胞。本申请的第三个目的在于提供一种成纤维细胞(LaViv)的培养方法，该培养方法包括以下步骤:a、按照医学或本领域常规方法获得成纤维细胞；b、使用上述的细胞培养基培养至细胞汇合度达80％-90％；c、每次传代皆用上述细胞培养基。本申请的第四个目的在于提供一种成纤维细胞(LaViv)及其应用，由上述细胞培养基培养获得的成纤维细胞，其活性高、分泌胶原蛋白量高，其更适用于在美容抗衰领域中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供培养基营养成分简单、配置方便，而且应用于培养成纤维细胞，不但提高成纤维细胞的活性，促进成纤维细胞分泌胶原蛋白，而且成纤维细胞应用人体后缩短了成纤维细胞抗衰除皱时间，对于迫切需求改善的治疗者缩短了等待时间，降低了治疗的经济成本和时间成本；而且本专利技术所使用的培养基成分简单配制简便，充分利用废弃资源，合理化开发废物再利用，变废为宝，节约成本。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1获得干细胞培养基的培养上清1.复苏脐带间充质干细胞至T-175培养瓶1.1按照DMEM：FBS：浓度为1％抗生素＝100:10:1配置细胞生长培养基，分别量取500mlDMEM、50mlFBS、5ml1％的抗生素，其中所述的抗生素为细胞培养中常规使用抗生素；1.2从液氮储存箱中取出脐带间充质干细胞的冻存管置于37℃恒温水浴锅解冻复苏；1.3解冻至有微小冰晶状态时迅速转至生物安全柜内；1.4将冻存管内液体吸入15ml离心管，并加入10mlPBS混匀后吸取20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞培养基，其特征在于：该培养基包括以下培养基成分：生长培养基和干细胞培养基的培养上清。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养基，其特征在于：该培养基包括以下培养基成分：生长培养基和干细胞培养基的培养上清。


2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于：上述生长培养基以高葡萄糖DMEM为基础培养基，添加0.5-15％(V/V)胎牛血清和0.05-1％浓度为1％的抗生素；细胞培养基中生长培养基和干细胞培养基的培养上清比例为0.1-100:0.1-30。


3.根据权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于：上述的干细胞培养基的培养上清是指干细胞在培养过程中使用的培养基，在干细胞培养过程中干细胞换液或者传代中而吸取丢弃的已培养干细胞的培养液。


4.根据权利要求1、3任一所述的细胞培养基，其特征在于：上述的干细胞可以为按功能划分的全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞或者专一性干细胞；也可以是按发育过程出现先后和分步分类的各种干细胞，如胚胎干细胞、成体干细胞等。


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【专利技术属性】
技术研发人员：杨一凡，刘丹，吴疆，王保如，
申请(专利权)人：安徽瑞达健康产业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34