一种细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞组合物在癌细胞KALS‑1上的应用，具体涉及γδT细胞和NK细胞组合物在KALS‑1上的应用。通过共培养诱导扩增方法获得γδT和NK细胞组合物，混合γδT和NK细胞毒性/活性强，对KALS‑1的作用强，几乎可以100％杀伤KALS‑1，为KALS‑1型癌症及疾病提供治疗方案；简化了在临床中治疗过程，简化了治疗手段，也降低了治疗成本。

Application of a cell composition in cancer cell kals-1

【技术实现步骤摘要】
一种细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用
：本专利技术涉及生物
，具体涉及免疫细胞在疾病上的应用，更具体涉及细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用。
技术介绍
：γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞。γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。此类T细胞主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3+T细胞的0.5％-1％。其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。γδT细胞所识别的抗原种类有限:①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。γδT细胞主要在胸腺中发育成熟，通过V(D)J基因重组产生γδT细胞受体(TCR)。通过特异性的基因重排，从一个共同淋巴细胞前体(commonlymphoidprecursor,CLP)分化为表达αβ受体和γδ受体的T细胞系。γδT细胞不易受抗原加工和呈递缺失的影响，因此γδT细胞具有很高的临床肿瘤免疫治疗潜在应用价值。γδT细胞在肿瘤免疫监视和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。γδT细胞作用还体现在：①γδT细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。②γδT细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。③γδT细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。④γδT能够利用细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。⑤γδT细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿瘤信号。⑥γδT细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达到人们理想中的效果。细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。在现有的研究中，大多采用单一的免疫细胞或杀伤性细胞进行细胞治疗或者在临床治疗中采用联合治疗的方式，在现有技术中，采用联合治疗需要花费更高的费用，为病患带来更多经济压力。因此解决上述现有的临床现象是急需的。
技术实现思路
针对上述所述问题，本专利技术提出了一种细胞组合物在神经胶质瘤细胞KALS-1上的应用，具体涉及γδT细胞和NK细胞组合物，该组合物在神经胶质瘤KALS-1上的应用。所述细胞组合物包括：γδT细胞和NK细胞。所述γδT细胞和NK细胞比例为1：0.5-10。上述细胞混合物在癌细胞KALS-1上的应用。上述γδT-NK细胞组合物获得方法：1：γδT细胞的获得；2：NK细胞的获得；3：γδT细胞和NK细胞混合细胞物诱导扩增共培养；4：15-20天γδT细胞和NK细胞混合细胞的获得。其中所述γδT细胞的获得包括如下步骤：(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；(2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～2000U/mLIL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mLanti-humanCD3Ab、10～500ng/mLanti-humanCD28Ab、10～200ng/mLIL-15、10～200ng/mLIL-21、500～3000U/mLIL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；(3)培养2～3天，待γδT细胞生长状态良好待后续使用。优选的，唑来膦酸浓度为5μM、anti-humanCD3Ab浓度为50ng/mL、anti-humanCD28Ab浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。优选的，单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞(iPSC)。在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640的比例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。其中NK细胞的获得包括如下步骤：(1)分离单个核细胞；(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞；(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/mlIL-15、10-500ng/mlIL-12、10-500ng/mlIL-21、10-500ng/mlIL-18和500-1500U/mlIL-2接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液，待细胞生长状态良好。上述所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。所述免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞可采用免疫磁珠、膜泡免疫分选和流式细胞仪免疫分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用。


2.根据权利要求1所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞比例为1：0.5-10。


3.根据权利要求2所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞和NK细胞制备方法如下：
(1)γδT细胞的获得；
(2)NK细胞的获得；
(3)γδT细胞和NK细胞混合细胞物诱导扩增共培养；
(4)15-20天γδT细胞和NK细胞混合细胞的获得。


4.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：γδT细胞的获得方法为：
(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；
(2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～2000U/mLIL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mLanti-humanCD3Ab、10～500ng/mLanti-humanCD28Ab、10～200ng/mLIL-15、10～200ng/mLIL-21、500～3000U/mLIL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(3)培养2～3天，待γδT细胞生长状态良好待后续使用。


5.根据权利要求3所述细胞组合物在癌细胞KALS-1上的应用，其特征在于：NK细胞的获得包括如下步骤：
(1)分离单个核细胞；
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【专利技术属性】
技术研发人员：邢永梅，邓蒙蒙，程箫，刘丹，吴疆，王保如，
申请(专利权)人：安徽瑞达健康产业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34