基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法，其是利用电化学活性分子通过癌细胞的特定适配体与癌细胞结合，使标有电化学活性分子的适配体DNA与细胞表面蛋白特异性的识别，再利用电化学方法进行检测，当电解质中的癌细胞与微电极发生碰撞时会产生电化学信号，由于微电极的有效面积很小，当细胞与电极发生碰撞，并粘附在电极表面上，通过研究细胞与微电极的相互作用，实现单一细胞的研究及单一癌细胞的识别，本发明专利技术的方法操作简单、灵敏度高、选择性好，可致力于癌症的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于癌细胞检测
，特别涉及一种通过电化学方法研究细胞与微电极的碰撞行为，实现单一细胞的检测方法，进而实现癌症的早期诊断。
技术介绍
细胞电化学是基于电化学原理、实验方法与细胞、分子生物学技术相互结合，对细胞进行分析和表征，研究或模拟研究细胞荷电离子或电活性粒子能量传递的运动规律，揭示细胞结构-功能关系和外源分子对细胞功能影响的一个新研究领域。目前电化学检测癌细胞，是将玻碳电极上镀一层纳米金，然后修饰DNA,再将细胞特异性的结合，根据电极修饰前后，电解池中K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6的电流信号的变化来检测细胞的。电极表面上修饰的DNA是大量的，那么结合的细胞也是很多的，该方法通常不能实现对单个细胞的检测。
技术实现思路
为了克服现有技术中的癌细胞检测技术所存在的不足，本专利技术提供了一种选择性好、灵敏度高以及实现单一癌细胞的检测与识别的，基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法。本专利技术实现上述目的所采用的技术方案由以下步骤组成：(1)将电化学活性分子或掺杂电化学活性分子的纳米粒子与能够特定识别癌细胞的适配体DNA通过共价键结合；(2)将待检细胞离心后，与步骤(1)的结合电化学活性分子的适配体DNA在4℃培养2h后，离心，洗涤，分散在浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲液中备用，使标有电化学活性分子的适配体DNA与细胞表面蛋白特异性的识别；(3)利用电化学工作站中的三电极体系进行电化学检测，以金微电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极、0.01mol/LpH＝7.4的磷酸缓冲液为电解液，将步骤(2)处理后的待检细胞注射到电解液中，待检细胞在电解池中自由运动，单一的待检细胞与微电极表面发生碰撞，并粘附在其表面上时，待检细胞上的电化学活性物质能够发生氧化反应，则产生电化学信号，即可确定该单一的待检细胞为癌细胞；若无电化学信号产生，则说明该细胞非癌细胞。上述电化学活性分子是二茂铁小分子、亚甲基蓝或联钌吡啶等。上述适配体DNA是AS1411或Sgc8c，其中AS1411的序列为NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，Sgc8c的序列为NH2-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA。上述纳米粒子是单质金属纳米粒子或无机化合物纳米粒子或复合纳米粒子，所述金属纳米粒子是金、铂、镍或银纳米粒子，所述复合纳米粒子是金/铂复合纳米粒子或金/二氧化硅复合纳米粒子，所述无机化合物纳米粒子为二氧化硅纳米粒子或碳量子点纳米粒子或者复勒烯C60纳米粒子。本专利技术所提供的基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法是利用电化学活性分子通过癌细胞的特定适配体与癌细胞结合，使标有电化学活性分子的适配体DNA与细胞表面蛋白特异性的识别，再利用电化学方法进行检测，当电解质中的癌细胞与微电极发生碰撞时会产生电化学信号，由于微电极的有效面积很小，当细胞与电极发生碰撞，并粘附在电极表面上，通过研究细胞与微电极的相互作用，实现单一细胞的研究及单一癌细胞的识别，本专利技术的方法操作简单、灵敏度高、选择性好，可致力于癌症的早期诊断。附图说明图1是二茂铁连接的细胞与微电极的碰撞的电流-时间关系曲线，直线表示无细胞电流-时间关系曲线，曲线表示有细胞的电流-时间关系曲线。图2是氨基化的掺杂联钌吡啶的二氧化硅的纳米粒子TEM图。图3是修饰有掺杂联钌吡啶的二氧化硅纳米粒子连接的细胞在恒电位下(电位为1.1V)与微电极碰撞的电流-时间关系曲线。具体实施方式现结合实施例和实验、附图对本专利技术的技术方案进行进一步说明，但是本专利技术不仅限于下述的实施情形。实施例1本实施例的电化学活性分子选择二茂铁小分子，特定识别癌细胞的适配体DNA选择AS1411(NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)，检测单一癌细胞的方法由下述步骤组成：(1)将二茂铁小分子与能够特定识别Hela细胞的适配体AS1411((NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)通过共价键结合，具体是：(1.1)活化羧基化的二茂铁小分子取纯化的二茂铁甲酸(Fc-COOH)102.5mg溶解在7mL二氯甲烷(简称DCM)中，加入质量比为5:2的EDC(N’-(乙基羰基亚氨基)-N,N-二甲基丙烷-1,3二氨基氯化物)/NHS(N-羟基丁二酰亚胺)中，在室温下，混合物在氮气氛围中持续搅拌17小时，反应完全后，混合物用水洗3次,每次用水量为8mL，水相用15mL的DCM提取，有机相被MgSO4干燥，混合物过滤，蒸发，生成中间产物Fc-NHS，使其易于和氨基化的DNA结合。(1.2)活化后的二茂铁与特定识别Hela细胞的适配体AS1411通过共价键结合。取中间产物溶解在50μL浓度为0.5mol/L、pH＝8.5的碳酸氢钠溶液，加入10μL的二甲基甲酰胺，再加入10μL200μmol/L的适配体AS1411，在4℃避光条件下，持续搅拌4h以使反应完全，将生成物溶解在浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲液中，以备使用。(2)将待检细胞用常规方法离心后加入步骤(1.2)的磷酸缓冲液中，使待检细胞与结合电化学活性分子的适配体DNA在4℃培养2h，常规离心、洗涤后，分散在浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲液中备用，由于DNA能与细胞表面蛋白特异性的结合，所以电化学物质二茂铁能有效标记在细胞表面。(3)利用电化学工作站中的三电极体系进行电化学检测，以金微电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极、0.01mol/LpH＝7.4的磷酸缓冲液为电解液，将步骤(2)处理后的待检细胞注射到电解液中，在恒电位(电位为1.1V)下，标记有二茂铁分子的待检细胞在电解液中自由移动，由于微电极的尺寸小，同时细胞之间存在电荷排斥和空间位阻，就容易实现单一细胞与微电极表面发生碰撞，当单一的待检细胞与微电极表面发生碰撞，并粘附在其表面上时，待检细胞上的二茂铁小分子能够发生氧化反应，瞬间产生增大明显的电流信号，如图1所示，即产生电化学信号，可确定该单一的待检细胞为Hela细胞；若无电化学信号产生，则说明该细胞并非是Hela细胞。实施例2本实施例的电化学活性分子选择联钌吡啶，纳米粒子是选用二氧化硅纳米...

【技术保护点】
一种基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)将电化学活性分子或掺杂电化学活性分子的纳米粒子与能够特定识别癌细胞的适配体DNA通过共价键结合；(2)将待检细胞离心后，与步骤(1)的结合电化学活性分子的适配体DNA在4℃培养2h后，离心，洗涤，分散在浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸缓冲液中备用，使标有电化学活性分子的适配体DNA与细胞表面蛋白特异性的识别；(3)利用电化学工作站中的三电极体系进行电化学检测，以金微电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极、0.01mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲液为电解液，将步骤(2)处理后的待检细胞注射到电解液中，待检细胞在电解池中自由运动，单一的待检细胞与微电极表面发生碰撞，并粘附在其表面上时，待检细胞上的电化学活性物质能够发生氧化反应，则产生电化学信号，即可确定该单一的待检细胞为癌细胞；若无电化学信号产生，则说明该细胞非癌细胞。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞的检测方法，其特
征在于由以下步骤组成：
(1)将电化学活性分子或掺杂电化学活性分子的纳米粒子与能够特定识
别癌细胞的适配体DNA通过共价键结合；
(2)将待检细胞离心后，与步骤(1)的结合电化学活性分子的适配体
DNA在4℃培养2h后，离心，洗涤，分散在浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的磷
酸缓冲液中备用，使标有电化学活性分子的适配体DNA与细胞表面蛋白特异
性的识别；
(3)利用电化学工作站中的三电极体系进行电化学检测，以金微电极为
工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极、0.01mol/LpH＝7.4的
磷酸缓冲液为电解液，将步骤(2)处理后的待检细胞注射到电解液中，待检
细胞在电解池中自由运动，单一的待检细胞与微电极表面发生碰撞，并粘附在
其表面上时，待检细胞上的电化学活性物质能够发生氧化反应，则产生电化学
信号，即可确定该单一的待检细胞为癌细胞；若无电化学信号产生，则说明该
细胞非癌细胞。
2.根据权利要求1所述的基于细胞与微电极的相互作用实现单一癌细胞
的检测方法，其特征在于：所述电化学活性分子是二茂铁小分子、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭志慧，吕晓琴，李敏，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61