一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法技术

本发明专利技术一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，是以双-(7-羟基-香豆素-8-醛)缩乙二胺为微量Zn2+的荧光探针，利用探针与Zn2+选择性形成配合物能发射457nm波长强烈荧光的特性，将探针及Zn2+分别渗透到活性癌细胞内，使之与细胞相容。通过探针对细胞内Zn2+染色后，用荧光倒置显微镜检测显现清晰的蓝色荧光细胞图像，探针用作活体癌细胞中Zn2+的荧光成像试剂。探针的化学结构式为：

【技术实现步骤摘要】
一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法
本专利技术属分析化学领域，具体地说是一种用于活体癌细胞中Zn2+检测的荧光探针方法。
技术介绍
细胞是生命活动的基本单位，是一切有机生命体构成的基础单元，细胞研究是所有基于生命科学研究的出发点，其生长、衰老等周期现象将直接影响生物体的生命活动。一些重金属和过渡金属元素因参与细胞生长发育、基因转录、神经传递等过程而具有非常重要的生理作用和功能，但当含量超过其相应的阈值时，它们对生物体的生长发育、生理代谢甚至于形态结构等会造成明显损伤。因此要研究各种离子对生物体的影响，非常必要的一步就是活体细胞内离子的在线可视化实时监测。活细胞成像技术是生命科学
中重要的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。近年来，随着生命科学的不断发展，人们对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细胞凋亡等方面的研究越来越深入。荧光显微成像技术是一种可以实现在线可视化实时检测细胞内离子的方法，此种方法较之其他手段不仅具有方法简便、灵敏度高、选择性好以及响应速度快等优点，更主要的是可以在不杀死细胞的情况下观察活体细胞，保持了细胞中最完整最真实的信息，使其成为最适合进行生物细胞内离子定量测定和定性分析的研究手段。同时，荧光显微镜还能通过观察细胞内特定位置的荧光确定被识别离子在细胞内的分布和动态变化，进行生物分子或亚细胞结构的细胞定位和动力学研究。Ghost等报道了的罗丹明衍生物应用于活体HeLa细胞中Hg2+的光学成像技术，其选择性优于一般的传感器，当向传感器溶液中加入Hg2+时会产生强烈的荧光，而向该体系中加入一定浓度KI时，荧光信号消失。Wang等报道了一种水杨醛苯腙类锌离子荧光探针，仅有Zn2+离子能引起配体荧光的显著增强，并将其应用于膀胱癌细胞内Zn2+离子的荧光成像分析，表明了该探针在生物化学体系中的应用前景。虽然报道的光学传感器分子较多，且具有较高的选择性，但由于水溶性、细胞穿透能力以及细胞毒性等原因，能应用于组织和细胞水平重金属和过渡金属离子光学成像的传感器分子仍较少，如何得到细胞毒性小，能穿透细胞壁或细胞膜，对重金属和过渡金属离子具有选择性的光学传感器是研究的主要难点之一。锌作为人体内含量仅次于铁的过渡金属元素，在细胞生物学和细胞营养过程中起着非常重要的作用，基因表达、蛋白质结构和功能、细胞代谢、酶的合成和神经传递以及疾病的产生等都与锌元素的含量密切相关。目前对锌离子的测定方法主要有原子吸收光谱法、分光光度法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、电化学法和荧光光谱法等，其中，荧光光谱法因具有发射信号为非破坏性，且快速，敏感的特点而备受关注。荧光传感器的主要目标是对出现在人体各种组织中，包括大脑、肠道、胰腺和视网膜的锌离子的检测。到目前为止，对锌离子的荧光传感器已经成功应用在活体细胞、海马切片的锌离子荧光成像。利用探针检测锌离子的相关报道已有不少，但真正能够应用到活细胞内成像的却不多。文献报道了一种以氨基硫脲和查尔酮为原料合成的探针，并将其用于神经元细胞内Zn2+的成像分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于研究一种能高灵敏、高选择的对活体癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法。通过专利技术人合成的一种对Zn2+高灵敏、高选择性检测识别的荧光探针，实现对活体细胞中微量Zn2+的荧光染色和成像。本专利技术所述一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法是以化合物双-(7-羟基-香豆素-8-醛)缩乙二胺为监测细胞内微量Zn2+的荧光探针，利用探针与Zn2+选择性形成配合物而发射强烈荧光的特性，探针、Zn2+能分别渗透到活癌细胞内，与细胞相容，通过探针与细胞内Zn2+结合发射荧光，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针用作活体癌细胞中Zn2+的荧光成像试剂。上述一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法是用探针对细胞内Zn2+进行染色，用显微镜观测细胞的荧光影像，具体方法为：1)细胞培养：活性前列腺癌（PC3）细胞经复苏接种于含10%胎牛血清和含1%双抗的培养基（RPMI1640）中，在温度为37℃，5%CO2及饱和湿度为100%的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长饱满的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml；2)探针与细胞孵化：次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入浓度为10μmol·L-1探针溶液{900μL培养基+100μmol·L-1探针的N,N-二甲基甲酰胺/H2O（DMF/H2O，v/v，1/4）的混合溶液100μL}中，在37℃的5%CO2、饱和湿度100%的培养箱中孵育30min，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；3)Zn2+对细胞染色：在上述经探针孵化过的细胞中再浸入含50μmol·L-1Zn2+溶液（900μL培养基+500μmol·L-1Zn2+溶液100μL），在37℃的5%CO2、饱和湿度100%的培养箱中孵育30min，进行细胞内探针对Zn2+染色，吸出含Zn2+溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培养基清洗三次，在荧光倒置显微镜下观察探针对细胞内Zn2+染色后的荧光成像，对细胞影像拍照获得清晰的细胞轮廓影像。上述一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，用浓度在1×10-5～1×10-4mol·L-1范围内的Zn2+对活体PC3细胞进行染色，Zn2+能渗透到细胞内，细胞呈圆滑饱满状；用浓度在1×10-5～2×10-5mol·L-1范围内的探针对细胞进行染色，探针能渗透到细胞内，细胞呈圆滑饱满状；探针、Zn2+与细胞具有良好的相容性，对细胞无毒性，不会使细胞凋亡；在上述浓度范围内，经探针溶液和Zn2+溶液染色过的细胞都能通过荧光倒置显微镜观察到蓝色荧光细胞分布图像，染色具有选择性聚集能力。上述一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，所用的试剂为分析纯或生化试剂，水为二次蒸馏水或生理盐水；活体PC3细胞为人体前列腺癌细胞；拍照设备为荧光倒置显微镜。上述一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，所述探针化学结构式为：分子式：C22H16N2O6分子量：404.10熔点：大于300℃溶解性：微溶于氯仿、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇。光谱性质：在DMF/H2O（v/v，1/4）混合溶剂中，360nm波长激发下，Zn2+的加入使探针在457nm处产生强烈荧光发射，在360nm波长产生最大紫外吸收。上述的一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，作为细胞中Zn2+检测的荧光成像试剂双-(7-羟基-香豆素-8-醛)缩乙二胺，其合成方法是以7-羟基香豆素、六次甲基四胺和乙二胺为原料，在二氯甲烷、乙醇为溶剂，以三氟乙酸为溶剂和催化剂，经过乙酰化、甲酰化、缩合反应而得。本专利技术所用的荧光探针作为细胞内的成像探针，满足了（1）良好的水溶性；（2）在生理条件下具有良好的热稳定性；（3）良好的膜穿透性，并且对细胞是无毒的；（4）与Zn2+有选择性、高灵敏的荧光增强作用，有较长的激发波长和较高的发光产率。利用探针在活体细胞内与Zn2+的染色作用，用荧光倒置显微镜能清晰获得发射蓝色荧光的细胞图像。专利技术了一种新颖的活体细胞的荧光成像技术。本专利技术合成的荧光探针的结构经核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，其特征是以化合物双‑(7‑羟基‑香豆素‑8‑醛)缩乙二胺为监测细胞内微量Zn2+的荧光探针，利用探针与Zn2+选择性形成配合物而发射强烈荧光的特性，探针、Zn2+能分别渗透到活癌细胞内，与细胞相容，通过探针与细胞内Zn2+结合发射荧光，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针用作活体癌细胞中Zn2+的荧光成像试剂。

【技术特征摘要】
1.一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，其特征是以化合物双-(7-羟基-香豆素-8-醛)缩乙二胺为监测细胞内微量Zn2+的荧光探针，利用探针与Zn2+选择性形成配合物而发射强烈荧光的特性，探针、Zn2+能分别渗透到活癌细胞内，与细胞相容，通过探针与细胞内Zn2+结合发射荧光，用荧光倒置显微镜检测出清晰的蓝色荧光细胞图像，探针用作活体癌细胞中Zn2+的荧光成像试剂。2.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞中Zn2+监测的荧光探针方法，其特征是用探针对细胞内Zn2+进行染色，用显微镜观测细胞的荧光影像，具体方法为：1)细胞培养：PC3活性前列腺癌细胞，简称PC3细胞，经复苏接种于含10％胎牛血清和含1％双抗RPMI1640的培养基中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长饱满的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml；2)探针与细胞孵化：次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞浸入浓度为10μmol·L-1探针溶液中，其组成由900μL培养基+100μL用体积比为1/4的N，N-二甲基甲酰胺/H2O配制的浓度为100μmol·L-1探针混合而成，在37℃的5％CO2、饱和湿度100％的培养箱中孵育30min，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞三次，荧光倒置显微镜下观察并进行亮场和暗场拍照；3)Zn2+对细胞染色：在上述经探针孵化过的细胞中再浸入含50μmol·L-1Zn2+溶液，其组成由900μL培养基+100μL浓度为500μmol·L-1的Zn2+溶液混合而成，在37℃的5％CO2、饱和湿度100％的培养箱中孵育30min，进行细胞内探针对Zn2+染色，吸出含Zn2+溶液的培养液，染色后的细胞再用新鲜培...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁剑英，李丽，沈韵，曾晞，牟兰，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52