超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法。通过原位生长法制备具有大的比表面积、良好的生物相容性和导电性的三维花状的纸金电极，利用其捕获目标癌细胞，通过癌细胞与特定适配体的特异性结合作用，将修饰有银纳米粒子的多枝杂交链负载在电极表面，然后在多枝杂交链上修饰和沉积大量的石墨烯量子点和银纳米粒子，完成电致化学发光细胞传感器的制备，利用多枝杂交链信号放大技术和银纳米粒子可以增强石墨烯量子点电致化学发光的性能实现信号放大，进而实现对癌细胞的超灵敏、准确检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌细胞分析检测技术、多枝杂交链信号放大技术、纸芯片技术及复合纳米材料
，更具体地说是一种用于超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备。
技术介绍
灵敏地检测癌细胞在癌症的早期检测、转移及治疗中具有重要的意义。到目前为止，一些检测方法像流式细胞术、聚合酶链反应、微量测定分析法和细胞浓缩方法已经被发展并用于癌细胞的检测。由于在血清中循环流通的肿瘤细胞的数量是非常少的，因此仍急需发展一种超灵敏、准确的检测癌细胞的分析方法。石墨烯量子点（GQDs）作为一种以碳为基础的发光材料，由于其无毒性、良好的生物相容性、水溶性及独特的光和电性能在电致化学发光（ECL）传感器中被广泛地应用。提高ECL传感器灵敏度的关键是提高GQDs的ECL响应。银纳米粒子（AgNPs）具有良好的导电性和生物相容性，其可以减小ECL发射源和工作电极之间的电子传播阻碍。基于AgNPs独特的性能，我们利用AgNPs增强GQDs的ECL发射，获得更强的ECL响应。目前，以DNA为基础的信号放大技术在生物分析中被广泛地利用。其中，多枝杂交链信号放大技术引起了广泛的研究兴趣，通过多枝杂交链反应，可以获得更长的带有多条分枝的DNA双螺旋，这种独特的DNA双螺旋结构有利于负载更多的GQDs和AgNPs，极大地放大ECL响应。为了进一步放大分析检测信号，我们利用AgNPs对Ag+良好的催化还原作用，在DNA双螺旋骨架上沉积更多的AgNPs，更高地增强GQDs的ECL响应，提高分析检测的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过原位生长法制备具有大的比表面积、良好的生物相容性和导电性的三维花状的纸金电极，利用其捕获目标癌细胞，通过癌细胞与特定适配体的特异性结合作用，将修饰有AgNPs的多枝杂交链负载在电极表面，然后在多枝杂交链上修饰和沉积大量的GQDs和AgNPs，完成ECL细胞传感器的制备，实现对癌细胞的超灵敏、准确检测。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下措施来实现的：（1）在计算机上利用AdobeillustratorCS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，将设计好的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130℃加热50秒使蜡融化并渗透整个色谱纸的厚度，形成疏水墙；（2）在计算机上设计与步骤（1）中获得的蜡打印图案相匹配的工作电极、对电极和参比电极的印刷图案，并利用丝网印刷技术在步骤（1）中获得的蜡打印色谱纸上印刷碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极；（3）利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长三维花状的金；（4）将伴刀豆球蛋白A修饰在步骤（3）中获得的纸芯片的工作区域，采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，然后利用伴刀豆球蛋白A捕获癌细胞；（5）将AgNPs修饰的多枝杂交链固定在步骤（4）中获得的纸芯片的工作区域；（6）将GQDs修饰在步骤（5）中获得的多枝杂交链上；（7）在步骤（6）中获得的多枝杂交链上沉积AgNPs；（8）在步骤（7）中获得的纸芯片的工作区域，滴加10μL包含0.1MK2S2O8的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS），在电压范围为0~-1.6V进行ECL信号检测，光电倍增管电压为800V，绘制ECL强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现对癌细胞的检测。本专利技术所述的利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长三维花状的金的具体步骤为：（1）合成金纳米粒子：首先将90mL二次水置于单口烧瓶中并加热到90℃，然后加入0.8mL1%氯金酸，继续水浴加热到96℃，待反应进行1min后，再加入2.8mL1%柠檬酸钠，在磁力搅拌下反应15min，获得酒红色的溶液；（2）取10-20μL金纳米粒子滴加到工作区域，在室温下静置反应30-60min，用二次水洗涤除去多余的金纳米粒子，取10-20μL新鲜制备的氯金酸和抗坏血酸的混合溶液滴加到工作区域，所述的氯金酸的浓度为10-15mM，抗坏血酸的浓度为80-120mM，在室温下生长20-40min后，用二次水清洗工作区域并在室温下自然干燥30min。本专利技术所述的将伴刀豆球蛋白A修饰在步骤（3）中获得的纸芯片的工作区域，采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，然后利用伴刀豆球蛋白A捕获癌细胞的具体步骤为：取10μL伴刀豆球蛋白A滴到纸工作区域，在室温下孵化30min，用pH7.4PBS洗涤除去多余的伴刀豆球蛋白A后，滴加10μL1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点，利用pH7.4PBS洗涤后，继续滴加10μL不同浓度的癌细胞，在37℃下孵化40min，随后用pH7.4PBS洗涤除去未反应的癌细胞。本专利技术所述的将AgNPs修饰的多枝杂交链固定在步骤（4）中获得的纸芯片的工作区域的具体步骤为：（1）合成AgNPs：首先制备20mL硝酸银和柠檬酸钠的混合溶液，所述的硝酸银和柠檬酸钠的浓度均为0.1-0.5mM且摩尔比为1:1，在磁力搅拌作用下，向混合液中加入0.5-1mL新鲜制备的浓度为10-20mM硼氢化钠，继续搅拌20-50秒，获得AgNPs溶液；（2）在发夹DNA分子1（H1）和发夹DNA分子2（H2）上连接AgNPs：将H1和H2溶解于pH5.0的三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中，静置处理1h，随后将活化的H1和H2用C18分离填充柱脱盐，并进行冷冻干燥，然后将冷冻干燥后的H1和H2溶解在1mL浓度为0.5M，pH7.6的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）中，获得的H1和H2浓度均为10μM且摩尔比为1:1，继续加入500μLAgNPs，缓慢地震荡5min后，加入15μL浓度为0.5M，pH3.0的柠檬酸盐缓冲溶液，在室温下孵化5min，随后继续加入15μL浓度为0.5M，pH3.0的柠檬酸盐缓冲溶液，在室温下孵化25min后，用pH7.6HEPES将混合液调节至中性，并用pH7.6HEPES离心洗涤5次，获得H1-Ag和H1-Ag；（3）多枝杂交链反应：将上述获得H1-Ag和H1-Ag溶解在1mL杂交链反应缓冲溶液（TM）中，所述的TM为pH8.0，浓度为20mM且含有50mMMgCl2的Tris缓冲溶液，然后用PTC-200热循环仪在95ºC加热10min，并在30s内冷却到4ºC，随后加入100μL捕获癌细胞的适配体链和引物链的混合液，所述的捕获癌细胞的适配体链和引物链的浓度均为5μM且摩尔比为1:1，最后将获得的混合液在37ºC反应12h，获得AgNPs修饰的多枝杂交链；（4）取10μL上述获得的AgNPs修饰的多枝杂交链滴加到步骤（4）中获得的纸芯片的工作区域，在37ºC孵化30min后，用pH7.4PBS洗涤除去未反应的多枝杂交链。本专利技术所述的将GQDs修饰在步骤（5）中获得的多枝杂交链上的具体步骤为：（1）合成GQDs:称取1-2g柠檬酸，置于25mL的小烧杯中，放在烘箱中于200ºC加热20-30min，待冷却至室温后，用浓度为1000M的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，获得黄棕色的GQDs溶液；（2）取10μL上述获得GQDs溶液滴加到步骤（5）中获得的纸芯片的工作区域，在室温下孵化2h后，用pH7.4PBS洗涤除去未反应的GQDs。本专利技术所述的在步骤（6）中获得的多枝杂交链上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，将设计好的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130 ℃加热50秒使蜡融化并渗透整个色谱纸的厚度，形成疏水墙；（2）在计算机上设计与步骤（1）中获得的蜡打印图案相匹配的工作电极、对电极和参比电极的印刷图案，并利用丝网印刷技术在步骤（1）中获得的蜡打印色谱纸上印刷碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极；（3）利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长三维花状的金；（4）将伴刀豆球蛋白A修饰在步骤（3）中获得的纸芯片的工作区域，采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，然后利用伴刀豆球蛋白A捕获癌细胞；（5）将AgNPs修饰的多枝杂交链固定在步骤（4）中获得的纸芯片的工作区域；（6）将GQDs修饰在步骤（5）中获得的多枝杂交链上；（7）在步骤（6）中获得的多枝杂交链上沉积AgNPs；（8）在步骤（7）中获得的纸芯片的工作区域，滴加10 μL包含0.1 M K2S2O8的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS），在电压范围为0 ~ ‑1.6V进行ECL信号检测，光电倍增管电压为800 V，绘制ECL强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现对癌细胞的检测。...

【技术特征摘要】
1.一种超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）在计算机上利用AdobeillustratorCS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，将设计好的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130℃加热50秒使蜡融化并渗透整个色谱纸的厚度，形成疏水墙；（2）在计算机上设计与步骤（1）中获得的蜡打印图案相匹配的工作电极、对电极和参比电极的印刷图案，并利用丝网印刷技术在步骤（1）中获得的蜡打印色谱纸上印刷碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极；（3）利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长三维花状的金；（4）将伴刀豆球蛋白A修饰在步骤（3）中获得的纸芯片的工作区域，采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，然后利用伴刀豆球蛋白A捕获癌细胞；（5）将AgNPs修饰的多枝杂交链固定在步骤（4）中获得的纸芯片的工作区域；（6）将GQDs修饰在步骤（5）中获得的多枝杂交链上；（7）在步骤（6）中获得的多枝杂交链上沉积AgNPs；（8）在步骤（7）中获得的纸芯片的工作区域，滴加10μL包含0.1MK2S2O8的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS），在电压范围为0~-1.6V进行ECL信号检测，光电倍增管电压为800V，绘制ECL强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现对癌细胞的检测。2.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法，其特征是，所述的利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长三维花状的金的具体步骤为：（1）合成金纳米粒子：首先将90mL二次水置于单口烧瓶中并加热到90℃，然后加入0.8mL1%氯金酸，继续水浴加热到96℃，待反应进行1min后，再加入2.8mL1%柠檬酸钠，在磁力搅拌下反应15min，获得酒红色的溶液；（2）取10-20μL金纳米粒子滴加到工作区域，在室温下静置反应30-60min，用二次水洗涤除去多余的金纳米粒子，取10-20μL新鲜制备的氯金酸和抗坏血酸的混合溶液滴加到工作区域，所述的氯金酸的浓度为10-15mM，抗坏血酸的浓度为80-120mM，在室温下生长20-40min后，用二次水清洗工作区域并在室温下自然干燥30min。3.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法，其特征是，所述的将伴刀豆球蛋白A修饰在步骤（3）中获得的纸芯片的工作区域，采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，然后利用伴刀豆球蛋白A捕获癌细胞的具体步骤为：取10μL伴刀豆球蛋白A滴到纸工作区域，在室温下孵化30min，用pH7.4PBS洗涤除去多余的伴刀豆球蛋白A后，滴加10μL1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点，利用pH7.4PBS洗涤后，继续滴加10μL不同浓度的癌细胞，在37℃下孵化40min，随后用pH7.4PBS洗涤除去未反应的癌细胞。4.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测癌细胞的电致化学发光细胞传感器的制备方法，其特征是，所述的将AgNP...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨红梅，张彦，李丽，徐金梦，于京华，葛慎光，颜梅，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37