针对现有生产D‑泛解酸内酯的菌株发酵过程中生物量偏低的问题，本发明专利技术公开了赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，所述赤霉菌(Gibberella sp.)RD016保藏号为CGMCC No.16374，属于微生物领域。本发明专利技术的赤霉菌(Gibberella sp.)发酵过程中生物量干重高达35g/L。同时本发明专利技术还提供一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在水解DL‑泛解酸内酯中的应用、赤霉菌(Gibberella sp.)RD016的发酵方法和赤霉菌(Gibberella sp.)RD016在制备D‑泛解酸内酯中的应用。
Application and fermentation of a Gibberella strain producing d-pantoprolactone hydrolase
【技术实现步骤摘要】
一株产D泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法
本专利技术属于微生物领域，具体地说，涉及一株产D泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法。
技术介绍
D-泛酸钙为维生素类药物，广泛应用于医药、食品、饲料工业。D-泛解酸内酯是合成D-泛酸钙及D-泛醇的重要前体物，因此从80年代起人们便对DL-泛解酸内酯进行拆分。现在对DL-泛解酸内酯拆分的方法主要有化学法、生物法。由于化学法存在试剂用量大、环境污染严重等缺点，因此人们对生物法进行了一系列的研究。生物法制备D泛解酸内酯主要有酶法，微生物法，已报道的研究有多种酶及微生物的技术路线。如今比较成熟的且已经应用到商业化的酶法为用微生物选择性水解D-泛解酸内酯，即利用微生物D-立体专一性内酯水解酶选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，D-泛解酸再经过内酯化反应生成D-泛解酸内酯，而L-泛解酸内酯并不被水解，未水解部分经过消旋化可反复使用。该方法不要求水解彻底，反应时间短，得到产品泛解酸内酯的光学纯度高，反应容易控制，底物的浓度可以很高。该方法的路线如下：国内江南大学孙志浩教授与浙江鑫富生化股份有限公司合作，其选育了一株高产量且立体专一性水解泛解酸内酯的微生物菌株串珠镰孢霉Fusadum.moniliformeSW-902(中国微生物菌种保藏号CGMCCNo.0536)，此菌株已经做为鑫富公司的生产菌株用于工业生产数十年，此菌株经过各种工艺优化后，专利报道的最终发酵生物量为干重6～8g/L，酶活力0.87-0.92U/g干菌体。得到的酶解产物D泛解酸光学纯度达到99％e.e.。此专利法的微生物活力及微生物产量都还有很大的提升空间。由此可知，现有生产D-泛解酸内酯的菌株，其发酵过程中生物量偏低。
技术实现思路
1、要解决的问题针对现有生产D-泛解酸内酯的菌株发酵过程中生物量偏低的问题，本专利技术提供一种赤霉菌(Gibberellasp.)RD016，所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016保藏号为CGMCCNo.16374。所述赤霉菌(Gibberellasp.)的发酵过程中生物量干重高达35g/L。同时本专利技术还提供一种赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用、赤霉菌(Gibberellasp.)RD016的发酵方法和赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在制备D-泛解酸内酯中的应用。2、技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种赤霉菌(Gibberellasp.)RD016，其保藏号为CGMCCNo.16374。赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用。优选的，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。优选的，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。优选的，所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016发酵所用的培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0；优选的，每升所述培养基中甘油38～40mL，葡萄糖25～30g，玉米浆25～32g，大豆蛋白粉20～30g硫酸镁3～3.4g，磷酸氢二钾2～2.4g，pH调至7.0～8.0；优选的，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0-8.0。上述的赤霉菌(Gibberellasp.)RD016发酵方法，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016先接种至发酵罐中的培养基发酵，接种量为0.1％～1％，发酵温度28～35℃，装液量50～70％，发酵过程中通气量为0.5～2vvm，pH为7.0～8.0，发酵时间96h～120h。优选的，所述培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0。优选的，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖28g，玉米浆28g，大豆蛋白粉20g，硫酸镁2.4g，磷酸氢二钾2.4g，pH调至7.0-8.0。赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在制备D-泛解酸内酯中的应用。优选的，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。3、有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术的赤霉菌(Gibberellasp.)RD016发酵过程中的生物量干重达到35g/L，现有技术中，相关生产菌株的发酵过程中生物量为干重6～8g/L。(2)本专利技术的赤霉菌(Gibberellasp.)RD016水解DL-泛解酸内酯后得到的D-泛解酸内酯的光学纯度达到96％e.e.，酶活达到41.1U/L，换算为菌体酶活为1.17U/g，转化率为45％～48％，现有技术中的生产菌株的酶活力为0.87-0.92U/g。生物保藏说明：本专利技术提供的赤霉菌(Gibberellasp.)，菌株名称为RD016，已于2018年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCCNo.16374。附图说明图1、高密度发酵酶活、生物量变化趋势；图2、菌体镜检照；图3、DL-泛解酸内酯的反向HPLC图；图4、DL泛解酸的反向HPLC图；图5、DL-泛解酸内酯正向手性柱HPLC图；图6、DL-泛解酸的正向手性柱HPLC图；图7、D泛解酸内酯标准品正向手性柱HPLC图；图8、重结晶后的D-泛解酸内酯正向手性柱HPLC图；图9a、L泛解酸内酯消旋前正向手性柱HPLC图；图9b、L泛解酸内酯消旋后正向手性柱HPLC图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术进行详细描述。实施例1菌株分离和鉴定从合肥市大蜀山森林公园土壤里，油脂厂，醋厂，酒厂，污水处理厂等，各采集土壤20g，称取5g加入无菌水500mL，于28℃、150rpm下孵育3h，后离心取上清液涂PDA抗生素平板，于28℃培养箱里培养。将平板上的单菌落进行单独培养支菌株，在PDA培养基基础上添加5g/L花生油继续筛选潜在D-泛解酸内酯水解酶菌株，根据透明圈和菌丝生长圈比例，选取RD01，RD02，RD03，RD04，RD05，RD06进行发酵实验。PDA培养基(1L)：葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4.7H2O1.5g，VB10.002g，氨苄青霉素50mg，琼脂15g，20％土豆汁。菌株在PDA培养基上生长良好，菌丝旺盛。实施例2产D-泛解酸内酯水解酶菌株筛选将RD01，R本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，其特征在于，其保藏号为CGMCC No.16374。
【技术特征摘要】
1.一种赤霉菌(Gibberellasp.)RD016，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.16374。2.权利要求1所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用。3.根据权利要求2所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。4.根据权利要求2所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，将所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016经过发酵后得到的湿菌体与DL-泛解酸内酯反应，生成D-泛解酸，然后D-泛解酸内酯化，得到D-泛解酸内酯。5.根据权利要求4所述的赤霉菌(Gibberellasp.)RD016在水解DL-泛解酸内酯中的应用，其特征在于，所述赤霉菌(Gibberellasp.)RD016发酵所用的培养基包括甘油、葡萄糖、玉米浆、大豆蛋白粉、硫酸镁和磷酸氢二钾，每升所述培养基中含有甘油30～46mL，葡萄糖20～36g，玉米浆20～36g，大豆蛋白粉20～36g，硫酸镁2～3.6g，磷酸氢二钾2～3.6g，pH调至7.0-8.0；优选的，每升所述培养基中甘油38～40mL，葡萄糖25～30g，玉米浆25～32g，大豆蛋白粉20～30g，硫酸镁3～3.4g，磷酸氢二钾2～2.4g，pH调至7.0～8.0；优选的，每升所述培养基中含有甘油46mL，葡萄糖2...
【专利技术属性】
技术研发人员：余继刚，史实，陈雷，汤伟强，王淯，汪晓东，廖志刚，杨靖昌，王娜娜，王保如，
申请(专利权)人：安徽瑞达健康产业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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