一种细胞组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞组合物，以及该细胞组合物在癌细胞SMMC‑7721及肝癌上的应用。具体涉及γδT细胞和NK细胞共培养细胞系及PD‑1/PD‑L1单抗和/或双特异性抗体，且细胞组合物中的γδT细胞和NK细胞通过共培养方式获得，先刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞和NK细胞，后通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的γδT细胞和NK细胞复合细胞物，扩增培养后的γδT‑NK细胞与PD‑1/PD‑L1单抗和/或双特异性抗体混合形成细胞组合物，组合物SMMC‑7721杀伤作用强。且该组合物制备方法提高细胞培养效率，大幅度降低培养成本，也降低了培养技术难度，简化了在临床中治疗过程，也降低了治疗成本，简化了治疗手段。

Application of a cell composition in cancer cell SMMC-7721

The invention discloses a cell composition and its application in cancer cell SMMC-7721 and liver cancer. Specifically, it involves co culture cell lines of \u03b3 \u03b4 T cells and NK cells, and PD \u2011 1 / PD \u2011 L1 monoclonal antibody and / or double specific antibody, and the \u03b3 \u03b4 T cells and NK cells in the cell composition are obtained by co culture. The mononuclear cells are first stimulated and induced to expand into \u03b3 \u03b4 T cells and NK cells, and then the \u03b3 \u03b4 cells with characteristics of large quantity, high expansion multiple and strong cytotoxicity are expanded through the living amplification culture The compound of T cell and NK cell, the expanded and cultured \u03b3 \u03b4 t \u2011 NK cell and PD \u2011 1 / PD \u2011 L1 monoclonal antibody and / or bispecific antibody are mixed to form a cell composition, which has strong killing effect on SMMC \u2011 7721. And the preparation method of the composition improves the cell culture efficiency, greatly reduces the culture cost, reduces the difficulty of culture technology, simplifies the treatment process in clinical, reduces the treatment cost and simplifies the treatment means.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用
：本专利技术涉及一种细胞组合物，组合物包括免疫治疗细胞和抗体，具体涉及γδT细胞和NK细胞共培养细胞系及PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用。
技术介绍
：肝脏恶性肿瘤可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。根据肝癌的不同阶段酌情进行个体化综合治疗，是提高疗效的关键；现有的治疗方法包括手术、肝动脉结扎、肝动脉化疗栓塞、射频、冷冻、激光、微波以及化疗和放射治疗等方法。生物治疗，中医中药治疗肝癌也多有应用。1.手术治疗：手术是治疗肝癌的首选，也是最有效的方法。手术方法有：根治性肝切除，姑息性肝切除等。对不能切除的肝癌可根据具体情况，采用术中肝动脉结扎、肝动脉化疗栓塞、射频、冷冻、激光、微波等治疗有一定的疗效。原发性肝癌也是行肝移植手术的指征之一。2.化学药物治疗：经剖腹探查发现癌肿不能切除，或作为肿瘤姑息切除的后续治疗者，可采用肝动脉和(或)门静脉置泵(皮下埋藏灌注装置)作区域化疗栓塞；对估计手术不能切除者，也可行放射介入治疗，经股动脉作选择性插管至肝动脉，注入栓塞剂(常用如碘化油)和抗癌药行化疗栓塞，部分患者可因此获得手术切除的机会。3.放射治疗：对一般情况较好，肝功能尚好，不伴有肝硬化，无黄疸、腹水、无脾功能亢进和食管静脉曲张，癌肿较局限，尚无远处转移而又不适于手术切除或手术后复发者，可采用放射为主的综合治疗。4.生物治疗：常用的有免疫核糖核酸、干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽等，可与化疗联合应用。5.中医中药治疗：采取辨证施治、攻补兼施的方法，常与其他疗法配合应用。以提高机体抗病力，改善全身状况和症状，减轻化疗、放疗不良反应。而现有的细胞免疫治疗成为目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。γδT细胞作用还体现在：①γδT细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。②γδT细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。③γδT细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。④γδT能够利用细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。⑤γδT细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿瘤信号。⑥γδT细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达到人们理想中的效果。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员，以PD-1为靶点的免疫调节在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面具有重要意义。在现有的技术研究中FDA已经批准PD-1/PD-L1抗体用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈癌、膀胱癌、默克尔细胞癌以及携带微卫星不稳定性高(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤。且在一些实体瘤中体现出有效的作用。在现有的研究中，大多采用单一的免疫细胞或杀伤性细胞进行细胞治疗或者在临床治疗中采用联合治疗的方式，在现有技术中，采用联合治疗需要花费更高的费用，为病患带来更多经济压力。因此，专利技术一种细胞组合物，组合物具体包括γδT细胞和NK细胞共培养细胞系及PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用，为肝癌患者治疗的带来希望。
技术实现思路
针对上述所述问题，本专利技术提出了一种细胞组合物，组合物具体包括γδT细胞和NK细胞共培养细胞系及PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用。且组合物中的γδT细胞和NK细胞通过共培养方式获得，先通过刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞和NK细胞，后通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的γδT细胞和NK细胞复合细胞物，扩增培养后的γδT-NK细胞同PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体复合形成一种细胞组合物，其具有非常好的临床应用价值。为了实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案：所述细胞组合物包括：γδT细胞、NK细胞及其PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体。所述细胞组合物的制备方法包括以下步骤：(1)γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得；(2)步骤1中的复合细胞物与PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体混合获得细胞组合物。其中细胞组合物中γδT细胞：NK细胞比例为0.5-20：10。其中细胞组合物中PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体含量为10-1000μg/ml细胞组合物。其中上述γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得方法如下：(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；(2)γδT-NK细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～3000U/mLIL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mLanti-humanCD3Ab、10～500ng/mLanti-humanCD28Ab、10～200ng/mLIL-15、10～200ng/mLIL-21、500～3000U/mLIL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；(3)培养2～3天，在培养瓶或培养袋中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；(4)培养4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶或培养袋中的细胞分别转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞组合物，其特征在于：包括免疫细胞和抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞组合物，其特征在于：包括免疫细胞和抗体。


2.根据权利要求1所述细胞组合物，其特征在于：免疫细胞为γδT细胞和NK细胞共培养细胞系，抗体为PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体。


3.根据权利要求2所述细胞组合物，其特征在于：细胞组合物的制备方法如下：
(1)γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得；
(2)步骤1中的复合细胞物与抗体混合获得细胞组合物。


4.根据权利要求2所述细胞组合物，其特征在于：细胞组合物中γδT细胞：NK细胞比例为0.5-20：10；细胞组合物中PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体含量为10-1000μg/ml细胞组合物。


5.一种细胞组合物的应用，其特征在于：细胞组合物应用于癌细胞SMMC-7721以及肝癌上，
所述组合物为权利要求1或权利要求2所述的细胞组合物中的一种。


6.根据权利要求3所述细胞组合物，其特征在于：γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得方法如下：
(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI1640和0％-50％X-vivo...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢永梅，邓蒙蒙，程箫，刘丹，吴疆，王保如，
申请(专利权)人：安徽瑞达健康产业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34