一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群，其为CD137

A cell subpopulation for immunotherapy of primary liver cancer and its preparation

The invention provides a cell subpopulation for immunotherapy of primary liver cancer, which is CD137

【技术实现步骤摘要】
一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法
本专利技术属于生物学领域，涉及一种免疫细胞，具体来说是一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法。
技术介绍
免疫疗法是指通过激活免疫系统来治疗疾病。在肿瘤治疗中，CAR-T疗法是使用较为广泛的免疫疗法。传统CAR-T疗法通过嵌合抗原受体改造PBMC细胞，提高T细胞对目的细胞的识别能力，经过体外大量扩增CAR-T细胞后回输到病人体内。此方法在实体肿瘤和血液肿瘤治疗中都取得过显著的疗效，但是治疗效果受个体差异影响大，仅在部分患者人群中有明显效果，整体治疗响应率不高。其原因主要有两点：若CAR-T的肿瘤特异性识别能力不高，容易发生脱靶效应；另外，第一代CAR-T方法改造的T细胞在回输到体内后，增殖和生存能力减弱，导致T细胞凋亡。随后的第二代CAR-T增加了共刺激信号，如CD28、4-1BB等，旨在增强T细胞分泌细胞因子、抗凋亡和增殖的能力。但目前为止，如何增强并保持T细胞的上述功能依然是CAR-T治疗的重点问题。除了PBMC细胞，肿瘤浸润的淋巴细胞(TumorInfiltratingLymphocyte，TIL)也是免疫治疗的研究热点。近年来，许多研究证明，肿瘤组织周围特异性的TIL的存在和病人良好的预后相关。目前的TIL治疗步骤包括了分离，筛选，扩增，回输4个阶段，从病人肿瘤组织中提取出的淋巴细胞加入高浓度的IL-2进行培养，筛选肿瘤特异性TIL，再进行扩增，大大提高了TIL治疗肿瘤疾病的有效性。TIL治疗方法也存在局限性：第一，TIL制备技术复杂，需要进行大量筛选；第二，目前的TIL治疗方法采用的是效应T细胞(effectorTcell),细胞寿命短，在体内无法维持长期生存。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种用于免疫治疗的细胞及其制备方法，所述的这种用于免疫治疗的细胞及其制备方法要解决现有技术中采用免疫技术治疗肿瘤疾病的效果不佳的技术问题。本专利技术提供了一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群，其为CD137+CD3+CD8+CD45RO+T细胞亚群。本专利技术还提供了上述用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群的制备方法，先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，经流式分选CD137+CD3+CD8+CD45RO+T细胞亚群，再进行体外扩增培养，获得用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群。进一步的，所述特异性标志物为CD137、CD3、CD8和CD45RO。本专利技术还提供了CD8+T细胞的CD137作为原发性肝细胞肝癌肿瘤反应性T细胞标记物的用途。本专利技术先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，所述特异性标志物包括CD137(TNFRSF9/4-1BB)，CD3,CD8,CD45RO，然后经流式分选CD137+CD3+CD8+CD45RO+T细胞亚群，并进行体外扩增，作为肿瘤浸润的T细胞免疫疗法的新方案。本专利技术的用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群具有更强的肿瘤杀伤效果、抗凋亡能力和增殖能力，能够在体内长期存活，旨在为肝癌的免疫治疗尤其是肿瘤浸润的T细胞免疫疗法提供有效候选细胞群，并为其他肿瘤的治疗提供新思路。同时肿瘤组织中CD8+T细胞CD137表达可作为HCC患者原发性肝细胞肝癌肿瘤反应性T细胞标记物，临床中可通过流式检测或者病理染色进行评估并指导预后。本专利技术和已有技术相比，其具有如下的优点：1)相对于其他肿瘤浸润的耗竭性T细胞，CD137+CD3+CD8+CD45RO+细胞群的肿瘤杀伤性能更强；2)相对于其他肿瘤浸润的耗竭性T细胞，CD137+CD3+CD8+CD45RO+细胞群的增殖和抗凋亡能力更强；3)相对于传统的PBMC改造扩增的CAR-T细胞，CD137+CD3+CD8+CD45RO+T细胞能够更好地特异性靶标癌细胞，效果更好。附图说明图1显示了肿瘤、腹水、外周血PBMC中CD137+细胞的比例，(A)代表性流式图，肿瘤、腹水、外周血PBMC中CD3+CD137+的比例；(B)统计分析结果，比较肿瘤、腹水、外周血PBMC中CD137+细胞的比例；(C)比较肿瘤、腹水中CD3+CD137+，CD8+CD137+，CD4+CD137+的比例。数据提示肿瘤内天然富集了一群CD137+T细胞。图2显示了肿瘤组织中CD137+和CD137-两群细胞的CD27,IFNγ，T-bet，IRF4，Blimp，NFAT1,Bcl2和Ki67的表达量检测，其中左边图为CD137-，右边图为CD137+。图3显示了CD137-CART剂量依赖性抑制肿瘤进展。(对照组为PBS组，其它为5x105，1x106，2x106细胞级别)具体实施方式实施例1CD8+T细胞是抗肿瘤免疫反应中的关键细胞，能够分泌细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)，攻击表面上具有主要组织相容性I类复合物(MHCI)的肿瘤细胞。浸润在肿瘤微环境中的CD8+T细胞易受到抑制因素的影响，最终造成功能耗竭及肿瘤的免疫逃逸。2016年Speiser等人提出，肿瘤中的耗竭性T细胞是存在异质性的。找到其中功能具有可塑性的T细胞将对免疫治疗很有帮助。我们将从原发性肝细胞肝癌(HCC)病人肿瘤中分离的CD3+CD45RO+细胞进行单细胞测序，发现肿瘤病人的CD8+T细胞大部分为耗竭状态。实验操作流程：将HCC病人的肿瘤组织和癌旁组织剪碎、研磨，70μM滤网过滤，经红细胞裂解液处理后，得到单细胞悬液。细胞重悬在1％胎牛血清的PBS溶液中，按抗体：体系＝1：200的体积比，加入anti-CD3和anti-CD45RO抗体，4℃标记30分钟。随后用PBS清洗细胞，并用PBS重悬细胞，按照染料：体系＝0.35：1000的体积比加入活细胞染料CalceinAM，室温孵育15分钟，用1％胎牛血清的PBS溶液清洗细胞并重悬，经流式过滤管过滤，进行流式分选，目的细胞为活性良好的CD3+CD45RO+细胞。分选过程按照说明书指示操作。收集的细胞经镜检，活性率≥90％，即可上机进行10XGenomics单细胞检测。另外将HCC病人的外周血提取外周血单核细胞，以及肿瘤组织和癌旁组织剪碎、研磨，70μM滤网过滤，经红细胞裂解液处理后，得到单细胞悬液。细胞重悬在1％胎牛血清的PBS溶液中，按抗体：体系＝1：200的体积比，加入anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8、anti-CD137抗体，4℃标记30分钟。随后用PBS清洗细胞，并用1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，进行流式检测(附图1)。分析发现肿瘤组织的耗竭性CD8+T细胞可分为CD137阳性和阴性表达两个亚群，这两群细胞的免疫应答相关基因表达存在大量差异，CD137阳性表达的T细胞群的IFNγ，CD27，HLA等基因的表达增强，表明其效应增强，而CD137阴性表达群的效应相对较弱。随后，在蛋白水平上对肿瘤中CD137+/-两群CD8+T细胞进行验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群，其特征在于：其为CD137

【技术特征摘要】
1.一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群，其特征在于：其为CD137+CD3+CD8+CD45RO+T细胞亚群。


2.权利要求1所述的一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群的制备方法，其特征在于：先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，然后经流式分选CD137+CD3+CD8+CD45RO+T细胞亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：武多娇，刘芳铭，王向东，刘卫仁，史颖弘，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31