一种成纤维细胞的快速提取方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种成纤维细胞的快速提取方法。包括以下步骤：S1）取离体的肿瘤组织，剪碎，加入胶原酶溶液进行消化；S2）转移到离心管中进行震荡、孵育及离心后，取沉淀物放进细胞培养箱中培养；S3）再加入胶原酶溶液进行消化，并重复步骤S2），得到经交替消化、培养后的组织结构松散的肿瘤组织；S4）加入胰酶溶液，常温静置后加入胎牛血清终止消化，再将悬浮物倒掉，得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞；S5）加入DMEM完全培养基进行传代培养，得到所述肿瘤相关成纤维细胞。还提供了本发明专利技术提取方法的应用，利用本提取方法得到的成纤维细胞纯度非常高，成纤维细胞高表达FAP，表达率为99.2%，适合医学推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，尤其涉及一种成纤维细胞的快速提取方法及应用。
技术介绍
肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤间质中最主要的细胞成分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着至关重要的角色。CAF可以募集内皮祖细胞到肿瘤局部促进肿瘤新生血管的生成和肿瘤的生长。这些肿瘤相关成纤维细胞除了表达vimentin这一成纤维细胞的标记物外，还特异性表达FAP、α-SMA，但不表达CK、desmin，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常成纤维细胞（NF）存在明显差异。肿瘤相关成纤维细胞目前是研究热点之一，很多机制尚存在争议，但是普遍认为该细胞与肿瘤的发生发展和转移侵袭有着密不可分的关系。肿瘤相关成纤维细胞能分泌趋化因子12（CXCL12）和肝细胞生长因子（HGF），前者能直接刺激肿瘤细胞进行增殖和转移，后者导致细胞外基质（ECM）的改变，进而造成体内上皮细胞增殖和发生恶性转化。除此之外，CXCL12和HGF与肿瘤分泌的血管内皮生长因子（VEGF）一起影响肿瘤新生血管的生成。以此方式，肿瘤相关成纤维细胞能同时影响正常上皮细胞和肿瘤细胞的旁泌性因子来影响肿瘤的发生发展，越来越多的证据表明肿瘤基质中成纤维细胞的突变往往发生在癌症发展之前。以肿瘤相关成纤维细胞为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。但是在现有的肿瘤相关成纤维细胞提取方法上，不能获得大量的肿瘤相关成纤维细胞，为研究其机制及作用带来很大的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种成纤维细胞的快速提取方法及应用。本专利技术的提取方法可以有效、快速提高肿瘤相关成纤维细胞的提取量及纯度。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种成纤维细胞的快速提取方法，包括以下步骤：S1）取离体的肿瘤组织，剪碎，然后往剪碎后的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化，得到胶原酶消化后的肿瘤组织；S2）将所述胶原酶消化后的肿瘤组织转移到离心管中进行震荡、孵育及离心后，取沉淀物放进细胞培养箱中培养，得到组织结构松散的肿瘤组织；S3）再加入胶原酶溶液进行消化，并重复步骤S2），得到经交替消化、培养后的组织结构松散的肿瘤组织；S4）向所述组织结构松散的肿瘤组织中加入胰酶溶液，常温静置后加入胎牛血清终止消化，再将悬浮物倒掉，得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞；S5）在所述胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞中加入DMEM完全培养基进行传代培养，得到所述肿瘤相关成纤维细胞。进一步地，在步骤S1），所述将离体的肿瘤组织剪碎前，还包括将离体的肿瘤组织在PBS中浸泡1-3min，所述PBS的摩尔浓度为0.01mol/L，所述胶原酶溶液为胶原酶Ⅰ溶液。进一步地，在步骤S1），所述摩尔浓度为0.01mol/L的PBS的配制方法为：将KCL 0.2g、KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g和Na2HPO4 1.44g 溶解于1000mL DDH2O中；所述胶原酶Ⅰ溶液中胶原酶Ⅰ的质量-体积浓度为0.8-1.5mg/mL。进一步地，在步骤S2），所述震荡的频率为1500-2000rpm，时间为2-4min；所述孵育为在35-38℃水浴锅中孵育1-3min；所述震荡和孵育交替进行2-4次。进一步地，在步骤S2），所述离心为将孵育后的肿瘤组织于300g下离心5-7 min，弃上清液；向沉淀中加入18-25 mL 摩尔浓度为0.01mol/L 的PBS，混匀后于300g下离心5-7min，弃上清液；再向沉淀中加入18-25 mL 摩尔浓度为0.01mol/L 的PBS，混匀后于300g下离心5-7min，弃上清液，取沉淀物即可。进一步地，在步骤S2），所述细胞培养箱中 CO2的体积百分比为6-8%，温度为35-38℃，培养的时间为1-3天。进一步地，在步骤S4），所述胰酶溶液的配制方法为：将NaCl 7-9g、NaHCO3 0.4-0.6g、葡萄糖0.8-1.2g、EDTA 0.2-0.4g及胰酶2.3-2.8g溶解于1000mL DDH2O中；所述常温静置的时间为1-2min。进一步地，在步骤S5），在进行传代培养之前，还包括用PBS将所述胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞洗涤2-3次；所述DMEM完全培养基为向DMEM不完全培养基中加入胎牛血清和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的体积百分比为10%，P/S的体积百分比为1%。本专利技术还提供了一种成纤维细胞的快速提取方法在提取肿瘤相关成纤维细胞的应用。更进一步地，所述肿瘤为实体瘤，该实体瘤为肺癌、肝癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一种或几种。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：利用本专利技术的成纤维细胞的快速提取方法得到的成纤维细胞纯度非常高，成纤维细胞高表达FAP，表达率为99.2%。显微镜下肿瘤相关成纤维细胞呈长梭形或星芒状，胞质丰富，嗜酸性，胞核位于胞体中央，圆形或长椭圆形，细胞呈放射状或束状排列，部分细胞排列紊乱，极性消失，有明显的交叉重叠现象。免疫细胞化学染色结果提示，成纤维细胞表面能特异性结合抗FAP单克隆荧光抗体，发出红色荧光。实验证明，可利用本专利技术的成纤维细胞的快速提取方法提取肿瘤相关成纤维细胞，适合医学推广。附图说明本专利技术将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图1为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。图2为剪碎的肿瘤组织。图3为肿瘤相关成纤维细胞显微镜下的细胞形态。图4为利用本专利技术提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的FAP表达率。图5为利用本专利技术提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的免疫细胞化学染色的实验结果。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。一、实施例中使用的材料及试剂眼科剪为大都器械医疗有限公司产品，型号为YYJ-PT＞10cm弯剪。该眼科剪头端宽0.4毫米，尖而不锐。人肝癌HepG2细胞（ATCC，货号HB-8065），公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。BALB/c裸鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司，货号401），公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。震荡器为IKA产品，型号为VORTX1。胎牛血清（FBS）为Gibco公司产品，货号10099-141。胶原酶Ⅰ溶液为向DMEM 不完全培养基（Gibco公司产品,货号11995-065）中加入胎牛血清和P/S（青霉素（索莱宝，货号P8420）和链霉素（索莱宝，货号S8290-5））得到的溶液，其中胎牛血清的体积百分比浓度为10%，P/S的体积百分比浓度为1%；P/S中胶原酶Ⅰ的浓度为100mg/mL。该胶原酶Ⅰ溶液中胶原酶Ⅰ的浓度为1mg/mL。胰酶溶液为向DDH2O中加入NaCl、NaHCO3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成纤维细胞的快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1）取离体的肿瘤组织，剪碎，然后往剪碎后的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化，得到胶原酶消化后的肿瘤组织；S2）将所述胶原酶消化后的肿瘤组织转移到离心管中进行震荡、孵育及离心后，取沉淀物放进细胞培养箱中培养，得到组织结构松散的肿瘤组织；S3）再加入胶原酶溶液进行消化，并重复步骤S2），得到经交替消化、培养后的组织结构松散的肿瘤组织；S4）向步骤S3）所述组织结构松散的肿瘤组织中加入胰酶溶液，常温静置后加入胎牛血清终止消化，再将悬浮物倒掉，得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞； S5）在所述胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞中加入DMEM完全培养基进行传代培养，得到所述肿瘤相关成纤维细胞。

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞的快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1）取离体的肿瘤组织，剪碎，然后往剪碎后的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化，得到胶原酶消化后的肿瘤组织；S2）将所述胶原酶消化后的肿瘤组织转移到离心管中进行震荡、孵育及离心后，取沉淀物放进细胞培养箱中培养，得到组织结构松散的肿瘤组织；S3）再加入胶原酶溶液进行消化，并重复步骤S2），得到经交替消化、培养后的组织结构松散的肿瘤组织；S4）向步骤S3）所述组织结构松散的肿瘤组织中加入胰酶溶液，常温静置后加入胎牛血清终止消化，再将悬浮物倒掉，得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞； S5）在所述胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞中加入DMEM完全培养基进行传代培养，得到所述肿瘤相关成纤维细胞。2.根据权利要求1所述的成纤维细胞的快速提取方法，其特征在于，在步骤S1），所述将离体的肿瘤组织剪碎前，还包括将离体的肿瘤组织在PBS中浸泡1-3min，所述PBS的摩尔浓度为0.01mol/L，所述胶原酶溶液为胶原酶Ⅰ溶液。3.根据权利要求2所述的成纤维细胞的快速提取方法，其特征在于，所述摩尔浓度为0.01mol/L的PBS的配制方法为：将KCL 0.2g、KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g和Na2HPO4 1.44g 溶解于1000mL DDH2O中；所述胶原酶Ⅰ溶液中胶原酶Ⅰ的质量-体积浓度为0.8-1.5mg/mL。4.根据权利要求1所述的成纤维细胞的快速提取方法，其特征在于，在步骤S2），所述震荡的频率为1500-2000rpm，时间为2-4min；所述孵育为在35-38℃水浴锅中孵育1-3min；所述震荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，卢小玲，周素芳，黄盈盈，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45