一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法技术

本发明专利技术涉及组织工程领域，具体是一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，包括以下步骤：将人原代成纤维细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2培养，每3‑5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代，培养120天以上。本发明专利技术人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的过程中没有利用到细胞重编程技术，没有外源性的干扰细胞的基因组成，保证了转化所得细胞的功能性和安全性。本发明专利技术将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞有望成为临床工作中创面修复的一种新手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程领域，具体地说，是医学创面修复
的一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法。
技术介绍
表皮细胞是皮肤组织工程的“种子细胞”，可以加速皮肤上皮化，促进创面愈合。自体表皮细胞体外扩增和移植技术与传统植皮手术相比具有损伤小、修复面积大、对患者全身情况影响小等优点。但表皮细胞的分离、培养和体外扩增难度很大，细胞培养过程中需要表皮细胞专用培养基，费用昂贵，细胞生长速度缓慢。成纤维细胞是机体疏松结缔组织的主要细胞成分，在人体中来源广泛，其分离、培养和体外扩增技术已经日臻完善。Sebe A等已成功将成纤维细胞诱导成为神经细胞、心肌细胞及多能干细胞。(Sebe A,Ivics Z.Reprogramming of Human Fibroblasts to Induced Pluripotent Stem Cells with Sleeping Beauty Transposon-Based Stable Gene Delivery.Methods Mol Biol.2016；1400:419-27)分离患者的成纤维细胞进行大量快速的体外扩增，而后将成纤维细胞诱导成为表皮细胞回植于患者自体创面，可以有效缩短创面上皮化时间，起到加速创面愈合的作用。2014年Chen Y等将p63和Klf4两种基因导入成纤维细胞，成功诱导出类表皮细胞，但该研究中发现诱导所得细胞与表皮细胞相比在功能方面存在明显差距，并且诱导所得的类表皮细胞存在癌变可能(Chen Y,Mistry DS,Sen GL.Highly rapid and efficient conversion of human fibroblasts to keratinocyte-like cells.J Invest Dermatol.2014Feb；134(2):335-44.)。到目前为止，未曾有将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞后成功应用于创面修复，且无致癌作用的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种将人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法。本专利技术通过获取临床上包皮环切患者术后的多余包皮，利用酶分离法分离所取组织的表皮和真皮层，并获取单个成纤维细胞进行培养。本专利技术成纤维细
胞转化为表皮细胞过程不包含细胞重编程、慢病毒质粒转染等改变细胞基因组成的操作。所得表皮细胞不仅保留了表皮细胞促进创面愈合，改善创面修复质量的特性，而且该细胞不具有致癌性。同时，本专利技术研究过程中发现同样条件下培养120天人脂肪成纤维细胞、瘢痕成纤维细胞和肿瘤成纤维细胞均不能转化为表皮细胞。本专利技术的第一方面，提供一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，包括以下步骤：将人原代成纤维细胞培养于含体积百分比10％的胎牛血清Fatal bovine serum(FBS)的Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco(DMEM)中，37℃、5％CO2培养箱中培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代，培养120天以上。本专利技术的鉴定试验证明，采用上述方法，在第100天，部分成纤维细胞转化为表皮细胞，在第120天，90％以上成纤维细胞转化表皮细胞。优选的，所述的人原代成纤维细胞是皮肤来源的人原代成纤维细胞。更优选采用人包皮组织获取的人原代成纤维细胞。所述的人原代成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：将皮肤组织利用洗必泰清洗，再用phosphate buffered saline(PBS)清洗，无菌条件下修剪，去除皮下组织，将修剪好的皮片浸入体积百分比0.25％的Dispase II酶，4℃消化16h。在无菌条件下钝性分离皮片表皮和真皮层，将真皮加入体积百分比0.2％胶原酶I 37℃水浴消化1h，以体积百分比10％的FBS培养基终止消化后将真皮组织过200目滤器研磨过滤，得到人原代成纤维细胞。本专利技术的第二方面，提供一种诱导得到的表皮细胞，采用上述任一所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法制备得到。所述的诱导得到的表皮细胞的培养和冻存方法：配制含体积百分比10％的二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比90％的FBS的冻存培养液，取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来移至15ml离心管中，离心1000rpm，5min，去除胰蛋白酶加入适量配制好的冻存培养液，调节细胞的密度为1×107/ml，利用程序降温冰盒冷冻细胞，而后移入液氮冻存备用。本专利技术的第三方面，提供上述诱导得到的表皮细胞的应用，用于制备促进创面愈合或改善创面修复质量的药物或制剂。本专利技术优点在于：1、本专利技术人原代成纤维细胞转化为表皮细胞操作方法简单，重复性好。过程中成纤维细胞和表皮细胞的培养都应用常用的DMEM培养基及细胞培养条件。而既往未有相关发现，可能是因为成纤维细胞转化为表皮细胞所需的转化周期长，本专利技术是一次意外事件偶然发现120天以上能够转化成表皮细胞。2、本专利技术人原代成纤维细胞转化为表皮细胞过程中，并未采用细胞重编程技术外源性诱导细胞基因变化，没有影响成纤维细胞本身的遗传特性。对于后期成纤维细胞转化表皮细胞过程中细胞形态、细胞基因表达和细胞功能等研究打下良好基础；也为后期明确转化机制，缩短转化时间，提高转化效率提供了研究条件。3、原代表皮细胞的分离、培养和体外扩增难度很大，培养基昂贵，生长缓慢。成纤维细胞的来源比较广泛，培养和扩增的技术相对比较成熟。诱导所得表皮细胞具有理想的功能性和安全性。诱导所得细胞保留了表皮细胞促进创面愈合，改善创面修复质量的特性，同时又不具备形成肿瘤的特性。附图说明图1为本专利技术中人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的过程。图2为G418筛选绿色荧光GFP阳性的成纤维细胞转化为表皮细胞的过程。图3为采用免疫荧光的方法鉴定人原代成纤维细胞向表皮细胞的转化过程。图4为细胞成球实验。图5为裸鼠荷瘤实验。图6为裸鼠全层皮肤缺损移植人原代成纤维细胞组(人原代成纤维细胞组)、人原代表皮细胞(人原代表皮细胞组)、诱导所得表皮细胞(诱导表皮细胞组)及空白对照组的创面愈合过程大体观。图7为裸鼠全层皮肤缺损移植术后24天病理切片HE染色图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1.成纤维细胞的制备和培养1、成纤维细胞的获取经医院伦理委员会批准，包皮切除患者知情同意，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的患者的手术切除包皮，利用洗必泰清洗5min×3遍，再用PBS清洗5min×3遍，无菌条件下修建包皮，去除包皮多余的真皮及皮下组织，将包皮修建为0.5×0.5cm大小的皮片，将皮片浸入0.25％Dispase II酶，4℃消化16h。在无菌条件下钝性分离皮片表皮和真皮层，将所得真皮加入0.2％胶原酶I 37℃水浴消化1h，以10％FBS培养基终止消化后将真皮组织过200目滤器研磨过滤，获取人原代成纤维细胞。2、人原代成纤维细胞的培养及鉴定将人原代成纤维细胞培养于含10％FBS的DMEM中，37℃、5％CO2培养箱中培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代(结果见图1)。图2采用免疫荧光技术，Vimentin和a-S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将人原代成纤维细胞培养于含体积百分比10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2培养，每3‑5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代，培养120天以上。

【技术特征摘要】
1.一种人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将人原代成纤维细胞培养于含体积百分比10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2培养，每3-5天换液，根据细胞的生长速度和细胞培养皿中成纤维细胞密度进行1:3传代，培养120天以上。2.根据权利要求1所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，所述的人原代成纤维细胞为人皮肤组织来源的人原代成纤维细胞。3.根据权利要求2所述的人原代成纤维细胞转化为表皮细胞的方法，其特征在于，所述的人皮肤组织来源的人原代成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：将皮肤组织利用洗必泰清洗，再用PBS清洗，无菌条件下修剪，去除皮下组织，将修剪好的皮片浸入体积百分比0.25％Dispase II酶，4℃消化16h；在无菌条件下钝性分离皮片表皮和真皮层，将真皮加入体积百分比0.2％胶原...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘善荣，张放，张丹丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31