一种诱导牛胎儿成纤维细胞重编程的方法技术

本发明专利技术属于细胞领域，公开了一种诱导牛胎儿成纤维细胞重编程的方法。本发明专利技术所述方法为牛胎儿成纤维细胞经毛地黄皂苷溶液透化处理后与爪蟾卵母细胞抽提物共孵育，用含2mM?CaCl2的全培养基封闭细胞膜上的可逆孔道，然后抽提物处理培养基培养诱导牛胎儿成纤维细胞重编程获得牛胎儿成纤维多能干细胞。本发明专利技术所述方法高效、稳定、安全。本发明专利技术所述牛胎儿成纤维多能干细胞碱性磷酸酶染色呈阳性，组蛋白H3K9乙酰化程度降低，有Oct-4蛋白及多能性标志基因Oct-4、Nanog的表达，表明牛胎儿成纤维细胞发生了重编程，细胞基因表达方式发生改变，表现干细胞特性，恢复部分发育全能性，可作为核供体制备克隆胚胎进行体细胞克隆。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞领域，具体涉及一种诱导体细胞重编程的方法，尤其涉及一种诱导牛胎儿成纤维细胞重编程成的方法。
技术介绍
自古以来，牛就是人类喜爱饲养的家畜。牛的用途广泛:肉和乳可供食物，皮是制革原料，角、骨也是工业原料，牛角还可做药材及工艺品，里内的牛黄更是珍贵的药材，而且牛还可为农业生产等提供役力和肥料。长久以来人们一直期望获得具有一定所需的特性或性质牛品种，例如高产肉量的肉牛品种，高产奶量、哺乳间隔期长以及疾病抵抗力强的奶牛品种等。传统的饲养方法最然能够培养出具有一些特定所需特性的牛品种，但通常这些特性伴随着一些不需要的性质，而且传统的饲养方法耗时、昂贵且遗传稳定性不可靠。哺乳动物体细胞克隆技术已有近20年的发展历史，其是指通过显微操作去核、核供体细胞的融合、重构胚激活等实验室手段，将某种类型的体细胞和核受体(一般是成熟卵母细胞)进行体外融合重构以形成克隆胚胎，再将克隆胚进行胚胎移植给代孕的母畜，达到大量生产遗传同质哺乳动物的一种生物技术。体细胞克隆技术具有四大优点:一是可以控制性别；二是成本低；三是克服国外引进优良品种的限制；四是可快速更新换代，扩繁优良品种。体细胞克隆技术在牛的养殖业中有重要的应用前景，对加速畜种改良、提高乳品质量有着重要的作用。应用体细胞克隆技术可以不受限制地保存某些个体的优良性状，并迅速地扩大优良个体的数量。体细胞克隆技术与转基因技术结合，可以大大提高转基因的效率，加速实现动物遗传的改造。体细胞克隆技术与乳腺反应器技术结合，可以直接从乳品中生产药用蛋白，或改良乳品质量。虽然体细胞克隆技术在小鼠、大鼠、牛、山羊、猪、猫、马、雪貂、狼、水牛等多种动物获得成功，但体细胞克隆的效率仍然很低，克隆胚胎的发育到期率不到5%，克隆动物存在着高流产率及新生胎儿高死亡率，只有极少数克隆动物能够健康存活至成年，这些都严重地制约着克隆技术的广泛应用和发展。目前认为造成体细胞克隆效率低的主要原因是高度分化的体细胞在卵母细胞质中重编程不完全，表观遗传修饰异常所致。而分化程度较低的细胞似乎有较强的重塑性，更易于发生蛋白的替换。因此将体细胞克隆与体细胞重编程相结合，诱导体细胞恢复到较低的分化状态，以分化程度较低的细胞作为核供体进行体细胞克隆以提闻克隆效率。体细胞重编程是指已分化的体细胞在特定条件下被逆转回原始多能状态或转分化为其他类型细胞。诱导体细胞重编程的方法主要有体细胞核移植、细胞融合、特定转录因子转导等。体细胞核移植是指将供体细胞移入去核卵母细胞中，在卵母细胞质中各种因子作用下，去分化恢复发育全能性，形成胚胎，移入受体后发育成新个体的过程。1997年世界首例成体细胞克隆绵羊Dolly诞生，证实了高度分化的体细胞有恢复全能性并发育成新个体的能力，开启了体细胞核移植研究的热潮。因此，体细胞核移植技术为研究体细胞重编程的分子机制提供了广阔的思路。体细胞核移植虽然在多种哺乳动物获得成功，但其机制仍不明确，供体核存在着重编程不完全、表观遗传修饰异常等现象，克隆效率很低，即使是在牛上，总效率也低于10% ;而且该技术还受到伦理道德和国家法规的干预，严重制约着这项技术的发展。细胞融合是指在自发或人工诱导下，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。实验证明在大多数杂交细胞中，分化程度较低的细胞往往占据主导地位。1976年，Miller和Ruddle首次证实细胞融合可以使体细胞重编程恢复多能性。他们将小鼠胸腺细胞与胚胎癌细胞杂交，产生的四倍体表达多潜能性细胞标志，将杂交细胞注入裸鼠中可以形成包含3个胚层组织的畸胎瘤。近年来体细胞与胚胎生殖细胞、胚胎干细胞进行的杂合也获得了相似的结果。虽然细胞融合技术避免了卵母细胞来源困难、基因操作复杂等问题，但多倍体的存在致使杂合体基因组不稳定，具有潜在风险；并且四倍体状态阻滞细胞的进一步发育，因此细胞融合后需移除来源于ES、EC、EG细胞的染色体，但目前尚未找到有效去除多余染色体的方法，细胞融合技术在体细胞重编程中的应用有较大的局限性。Yamanaka和Takahashi将4个对细胞重编程至关重要的因子0ct4、Sox2、Klf4和C-Myc导入小鼠成纤维细胞，获得类胚胎干细胞性质的诱导多潜能性干细胞，具有强大的更新能力和分化潜能，这一里程碑式的发现，开启了特定转录因子诱导体细胞重编程研究的新篇章。特定转录因子诱导体细胞重编程，实现了细胞命运的直接转变，摒弃了干细胞和卵母细胞带来的伦理道德问题，在细胞治疗和再生医学方面有广阔的应用前景。但目前细胞诱导效率低，且面临诱发癌症的威胁，严重制约着它的应用。因此，进一步探究重编程机制，建立高效、稳定、安全的诱导体细胞重编程的方法是目前科学界亟待解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高效、稳定、安全的诱导牛胎儿成纤维细胞重编程的方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案:，牛胎儿成纤维细胞经毛地黄皂苷溶液透化处理后与爪蟾卵母细胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培养基封闭细胞膜上的可逆孔道，然后抽提物处理培养基培养诱导牛胎儿成纤维细胞重编程获得牛胎儿成纤维多能干细胞。优选的，所述牛胎儿成纤维细胞由40日龄牛胎儿躯干部组织经75%酒精和含1%双抗的PBS中漂洗后在T25培养瓶中经全培养基培养得到。优选的，所述毛地黄皂苷溶液浓度为7 μ g/mL。优选的，所述透化处理为在0°C条件下处理2min。优选的，所述爪蟾卵母细胞抽提物制备方法为爪蟾卵去卵胶膜后经细胞裂解液裂解再经高速离心破碎后收集卵母细胞粗提物。优选的，所述共孵育为在23°C条件下与共孵育lh。优选的，所述封闭的时间为2h。优选的，所述培养的时间为6-7d。本专利技术还提供了上述方法重编程得到的牛胎儿成纤维多能干细胞。本专利技术提供了，所述方法为牛胎儿成纤维细胞经毛地黄皂苷溶液透化处理后与爪蟾卵母细胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培养基封闭细胞膜上的可逆孔道，然后抽提物处理培养基培养诱导牛胎儿成纤维细胞重编程获得牛胎儿成纤维多能干细胞。本专利技术所述方法高效、稳定、安全。经本专利技术所述方法诱导重编程得到的牛胎儿成纤维多能干细胞碱性磷酸酶染色呈阳性，组蛋白H3K9乙酰化程度降低，有Oct-4蛋白及多能性标志基因0ct-4、Nanog的表达，表明牛胎儿成纤维细胞发生了重编程，细胞基因表达方式发生改变，表现干细胞特性，恢复部分发育全能性，可作为核供体制备克隆胚胎进行体细胞克隆。【附图说明】图1示实施例5爪蟾卵母细胞抽提物处理的牛胎儿成纤维细胞和对照细胞(100X )，其中，图中A为待处理细胞、图中B为抽提物处理中细胞、图中C为抽提物处理后细胞、图中D为抽提物处理后6d细胞形成“克隆簇”、图中E为6d抽提物处理培养基培养的未经处理对照细胞、图中F为6d常规培养基培养的未经处理对照细胞；图2示实施例6爪蟾卵母细胞抽提物处理的牛胎儿成纤维细胞和未经处理对照细胞H3K9免疫荧光染色分析结果图，其中实验组为爪蟾卵母细胞抽提物处理的牛胎儿成纤维细胞，对照组为未经处理对照细胞；图3示实施例7爪蟾卵母细胞抽提物处理的牛胎儿成纤维细胞和未经处理对照细胞碱性磷酸酶染色图(100X )，其中，图中A为抽提物处理后6d细胞形成克隆簇、图中B为克隆簇碱性磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导牛胎儿成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，牛胎儿成纤维细胞经毛地黄皂苷溶液透化处理后与爪蟾卵母细胞抽提物共孵育，用含2mM?CaCl2的全培养基封闭细胞膜上的可逆孔道，然后抽提物处理培养基培养诱导牛胎儿成纤维细胞重编程获得牛胎儿成纤维多能干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种诱导牛胎儿成纤维细胞重编程的方法，其特征在于，牛胎儿成纤维细胞经毛地黄皂苷溶液透化处理后与爪蟾卵母细胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培养基封闭细胞膜上的可逆孔道，然后抽提物处理培养基培养诱导牛胎儿成纤维细胞重编程获得牛胎儿成纤维多能干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛胎儿成纤维细胞由40日龄牛胎儿躯干部组织经75%酒精和含1%双抗的PBS中漂洗后在T25培养瓶中经全培养基培养得到。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛地黄皂苷溶液浓度为7μ g/mL。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜卫华，范宗兴，朱化彬，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：