一种转化态纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法技术

本发明专利技术公开了种“转化态”纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法，将正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分别在培养基中培养后分别取至少三皿细胞分为至少三组，每组中包括一皿正常小鼠胚胎成纤维细胞和一皿含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞，并标记组别；待细胞生长至对数期后，弃去培养液，向第一组中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向第二组中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向第三组中加入含有“转化态”纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；去除条件培养基后漂洗每组中的每皿细胞；循环培养；该方法具有简单、易于操作、成本低、结果可靠等优点，适合大规模推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米材料生物安全领域，具体为一种转化态纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法。
技术介绍
纳米材料已成为人类广泛接触的一种新型环境污染物，被证实可致DNA损伤和基因突变，但其致/促癌性目前尚无定论。为何纳米材料可致突却未见致癌？可能是由于目前研究思路和研究手段受限。目前对于纳米材料的毒性效应及致癌性研究多是针对合成之后未进入环境的“原始态(pristine)”纳米材料，而对纳米材料在环境因素作用下理化性质及其存在状态的变化与其毒性及致癌性的关联往往缺少必要的考虑，也就是说目前所作的纳米安全性评估并不全面。近几年的研究表明即使同一种纳米材料也会因环境因素的不同作用而表现出完全不同的理化性质和存在状态，这使得环境中纳米材料的毒理学效应及机制研究存在诸多的不确定性。也就是说，原初状态的纳米材料未显示致癌性，不能说明被释放到环境中在各种环境因素影响下可能发生物理化学性质转变和存在状态改变的转化态纳米材料依然不具有致癌性。这是当前纳米材料生物安全性评价中迫切需要解决的关键科学问题之一，也是纳米材料致癌性研究需要考虑的重要问题之一。纳米材料的理化性质和遗传毒性均可受到自然环境条件的剧烈影响，从而导致“原始态”的纳米材料的毒性不能准确反映环境中转化态纳米材料的真实毒性；因此需设计一种用转化态纳米材料致细胞恶性转化的有效暴露方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转化态纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：步骤如下：步骤一：将正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分别在培养箱中的含胎牛血清的DMEM培养基中培养；步骤二：分别取至少三皿经过所述步骤一处理的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分为至少三组，每组中包括一皿正常小鼠胚胎成纤维细胞和一皿含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞，并标记组别；步骤三：待所述步骤二中的三组细胞生长至对数生长期后，均弃去所述步骤二中的培养液，向所述第一组细胞中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向所述第二组细胞中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向所述第三组细胞中加入含有转化态纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；步骤四：去除所述步骤三中的条件培养基后漂洗每组中的每皿细胞；步骤五：向经过所述步骤四处理的第一组细胞中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向所述第二组细胞中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向所述第三组细胞中加入含有转化态纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；步骤六：循环所述步骤二到步骤五。优选的，所述步骤二中的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞均处于对数生长期，满度为80％，种植数目均为1×105，所述培养皿大小为60mm，所述每组细胞均经过胰蛋白酶酶解消化。优选的，所述DMEM培养基中均含有10％体积的胎牛血清，所述步骤三或步骤五中加入的DMEM培养基量均为4ml，所述第二组细胞中加入的DMEM培养基中还含有纳米材料浓度为1.5μg/ml的新鲜液，所述第三组细胞中加入的DMEM培养基中还含有浓度为1.5μg/ml转化态纳米材料悬浊液。优选的，所述步骤四中的每皿细胞均用1.5ml磷酸盐缓冲液漂洗细胞3遍。优选的，所述步骤六连续暴露40代至80代，期间每隔5代冻存部分细胞。优选的，所述步骤三或者步骤二中的每组细胞在加入培养基后培养24h，所述步骤五中的每组细胞在加入培养基后连续培养3d。优选的，所述转化态纳米材料的制备步骤如下：步骤一、将纳米材料用超纯水悬浮，得到新鲜液；步骤二、将步骤一中的新鲜液调整pH值为6-9后灭菌得到储备液，将所述储备液在25℃下避光保存60d；步骤三、取经过步骤二处理的储备液放入震荡仪中涡旋震荡；步骤四、将经过步骤三处理的储备液放入超声分散仪中超声分散；步骤五、将经过步骤四处理的储备液进行稀释；步骤六、将步骤五中的储备液放入震荡仪中涡旋震荡，得到转化态纳米材料悬浊液。优选的，所述步骤一中的新鲜液中纳米材料浓度为1mg/mL，所述步骤三和步骤六中的涡旋震荡的时间均为3min，所述步骤四中超声分散的时间为20min，所述步骤五中储备液稀释后的纳米材料浓度为100μg/ml。优选的，所述步骤二中的储备液的pH值为6，避光保存天数为60d。优选的，所述纳米材料为粒径90nm-200nm的纳米氧化锌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的致哺乳动物细胞恶性转化的有效暴露方法，可克服利用细菌进行纳米材料毒性效应研究的各种缺点和不确定性；针对已确定发生了转化的转化态纳米材料进行哺乳动物细胞进行长期的低剂量的慢性暴露，获得并冻存受纳米材料慢性刺激20代、40代、60代甚至80代的稳定的细胞，可避免因急性短时间暴露不适用于研究致癌性这一缺点，对纳米材料致癌性的时间效应进行分析和研究。本专利技术提供的方法简单，易于操作，成本低，结果可靠，可对各种形式的转化态纳米材料开展致哺乳动物细胞恶性转化研究，可对慢性暴露不同时间段的细胞进行分析，适合大规模推广。附图说明图1为本专利技术转化态纳米氧化锌导致正常的小鼠胚胎成纤维细胞克隆形成能力提高的示意图；图2为本专利技术转化态纳米氧化锌导致含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞软琼脂集落形成能力提高的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1.本专利技术提供一种技术方案步骤如下：步骤一：将正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分别在培养箱中的含胎牛血清的DMEM培养基中培养；步骤二：分别取三皿经过所述步骤一处理的处于对数生长期，满度为80％的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分为三组，每组中包括一皿正常小鼠胚胎成纤维细胞和一皿含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞，并标记组别，每皿种植数目均为1×105，培养皿大小为60mm，每组细胞均经过胰蛋白酶酶解消化；步骤三：待步骤二中的三组细胞生长至对数生长期后，均弃去步骤二中的培养液，向第一组细胞中加入4ml含10％体积的胎牛血清的DMEM培养基，向第二组细胞中加入4ml含有纳米材料浓度为1.5μg/ml的新鲜液和10％体积的胎牛血清的DMEM培养基，向第三组细胞中加入4ml含有浓度为1.5μg/ml转化态纳米材料悬浊液且含10％体积的胎牛血清的DMEM培养基；步骤四：去除步骤三中的条件培养基后用1.5ml磷酸盐缓冲液漂洗细胞3遍；步骤五：向经过步骤四处理的第一组细胞中加入4ml含10％体积的胎牛血清的DMEM培养基，向第二组细胞中加入4ml含有纳米材料浓度为1.5μg/ml的新鲜液和10％体积的胎牛血清的DMEM培养基，向第三组细胞中加入4ml含有浓度为1.5μg/ml转化态纳米材料悬浊液且含10％体积胎牛血清的DMEM培养基；步骤六：循环步骤二到步骤五，连续暴露40代至80代，期间每隔5代冻存部分细胞；其中转化态纳米材料的制备步骤如下：步骤一、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种“转化态”纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法，其特征在于步骤如下：步骤一：将正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分别在培养箱中的含胎牛血清的DMEM培养基中培养；步骤二：分别取至少三皿经过所述步骤一处理的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分为至少三组，每组中包括一皿正常小鼠胚胎成纤维细胞和一皿含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞，并标记组别；步骤三：待所述步骤二中的三组细胞生长至对数生长期后，均弃去所述步骤二中的培养液，向所述第一组细胞中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向所述第二组细胞中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向所述第三组细胞中加入含有“转化态”纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；步骤四：去除所述步骤三中的条件培养基后漂洗每组中的每皿细胞；步骤五：向经过所述步骤四处理的第一组细胞中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向所述第二组细胞中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向所述第三组细胞中加入含有“转化态”纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；步骤六：循环所述步骤二到步骤五。

【技术特征摘要】
1.一种“转化态”纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法，其特征在于步骤如下：步骤一：将正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分别在培养箱中的含胎牛血清的DMEM培养基中培养；步骤二：分别取至少三皿经过所述步骤一处理的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞分为至少三组，每组中包括一皿正常小鼠胚胎成纤维细胞和一皿含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞，并标记组别；步骤三：待所述步骤二中的三组细胞生长至对数生长期后，均弃去所述步骤二中的培养液，向所述第一组细胞中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向所述第二组细胞中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向所述第三组细胞中加入含有“转化态”纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；步骤四：去除所述步骤三中的条件培养基后漂洗每组中的每皿细胞；步骤五：向经过所述步骤四处理的第一组细胞中加入含胎牛血清的DMEM培养基，向所述第二组细胞中加入含有新鲜液和胎牛血清的DMEM培养基，向所述第三组细胞中加入含有“转化态”纳米材料悬浊液且含胎牛血清的DMEM培养基；步骤六：循环所述步骤二到步骤五。2.根据权利要求1所述的一种“转化态”纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法，其特征在于：所述步骤二中的正常小鼠胚胎成纤维细胞和含激活突变的小鼠胚胎成纤维细胞均处于对数生长期，满度为80％，种植数目均为1×105，所述培养皿大小为60mm，所述每组细胞均经过胰蛋白酶酶解消化。3.根据权利要求1所述的一种“转化态”纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的暴露方法，其特征在于：所述DMEM培养基中均含有10％体积的胎牛血清，所述步骤三或步骤五中加入的DMEM培养基量均为4ml，所述第二组细胞中加入的DMEM培养基中还含有纳米材料浓度为1.5μg/ml的新鲜液，所述第三组细胞中加入的DMEM培养基中还含有浓度为1.5μg/ml“转化态”...

【专利技术属性】
技术研发人员：王妹梅，杜华，汪思应，刘亚坤，曹瑞，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34