一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法技术

本发明专利技术公开一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚；2)胰酶冲洗；3)匀浆；4)消化；5)分散；6)传代培养，得到鸡胚成纤维细胞。本发明专利技术提供的方法得到的鸡胚成纤维细胞收获量相较于传统的方法，收获量提高20倍以上且操作时间短。经实践证明，每个鸡胚可以传10‑20个T225的细胞瓶。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法,属于细胞培养

技术介绍
鸡胚成纤维细胞(CEF)除了应用于病毒学领域的相关研究，还广泛用于兽用疫苗生产，例如传染性法氏囊病、马立克病、新城疫等，也可用为表达一些基因工程产物等。目前报道分离鸡胚成纤维细胞的方法多种多样，主要适合应用于实验室制备少量鸡胚成纤维细胞，其通常包括无菌取鸡胚，去头、四肢、内脏等，剪碎，PBS或Hank’s溶液洗涤，胰酶消化，吹散，纱布过滤，离心回收细胞、细胞计数、培养等步骤。其操作步骤繁多容易污染，操作时间长通常需要3个小时左右，并且收获的鸡胚成纤维细胞非常少，完全不适合大量生产。因此，本专利技术致力于解决上述问题，快速制备大量的CEF细胞。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种细胞收获量高、操作时间短的快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取9-11日龄SPF鸡胚，消毒，无菌操作取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5-1cm块状组织；然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗，去除红细胞；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，轻晃混匀使进行消化；5)分散：吸取步骤4)消化后得到的上清液，转移至细胞瓶，吹打1-3min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的细胞瓶内加入含有胎牛血清的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，24-32h后更换培养基，传代培养，得到鸡胚成纤维细胞。作为优选，步骤1)中，具体消毒步骤为：采用75vt％酒精棉擦拭鸡胚，用火焰消毒胚蛋。作为优选，步骤2)中，胰酶溶液的体积是组织块的体积的1-10倍。作为优选，步骤2)中，胰酶溶液的体积是组织块的体积的3-5倍。作为优选，步骤4)中，胰酶溶液的体积是组织块的体积的1-10倍。作为优选，步骤4)中，胰酶溶液的体积是组织块的体积的3-5倍。作为优选，步骤4)中，轻晃3-5min。作为优选，步骤5)中，使用移液管进行转移。作为优选，步骤6)中，胎牛血清的浓度为10wt％。作为优选，步骤6)中，所述培养基为1640培养基。本专利技术的配方设计原理如下：相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的方法得到的CEF细胞收获量相较于传统的方法，收获量提高20倍以上且操作时间短。经实践证明，每个鸡胚可以传10-20个T225的细胞瓶。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：本专利技术提供一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取9-11日龄SPF鸡胚，消毒，无菌操作取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5-1cm块状组织；然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗；本步骤中，胰酶冲洗的目的在于去除大量红细胞，以减少干扰；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；使用匀浆机可快速获得体积均一性较好的鸡胚组织；组织块的直径小于1mm，组织块接触胰酶的面积大，更容易消化，有利于收集到更加均一的细胞；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，轻晃混匀使进行消化；通过胰酶冲洗结合消化，能有效地提高消化的效率，同时有利于大量地的获得均一的细胞；而胰酶的浓度过低消化过程将过慢，过高则细胞操作过大；5)分散：吸取步骤4)消化后得到的上清液，转移至细胞瓶，转移至细胞瓶，吹打1-3min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的细胞瓶内加入含有胎牛血清的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，24-32h后更换培养基，传代培养；更换培养基以去除少量细胞等不贴壁的细胞，减少杂质，以提高鸡胚成纤维细胞的纯度。采用上述方法获得的CEF细胞收获量相较于传统的方法，收获得提高20倍以上且操作时间短。经实践证明，每个鸡胚可以传10-20个T225的细胞瓶。实施例1:一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取11日龄SPF鸡胚，放入超净台，用75％酒精棉擦拭消毒后,用火焰消毒胚蛋，气室的部位朝上，用无菌镊子磕破蛋壳，换用新的无菌镊子取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5-1cm块状组织,然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗2次，胰酶溶液的体积是组织块的体积的5倍；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，胰酶溶液与组织块的体积比为3：1，轻晃4min使进行消化；5)分散：将步骤4)消化后得到的上清液用移液管转移至T225细胞瓶，吹打2min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的T225细胞瓶内加入含有10wt％胎牛血清的1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后更换培养基，传代培养，得到鸡胚成纤维细胞。本实施例1中，经过多次依次进行的“胰酶冲洗、匀浆和消化”就可大量获得含有细胞的上清液，从而可以进行大量培养。本实施例中，每个鸡胚分离到的成纤维细胞可以传15个T225的细胞瓶。实施例2：一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取9日龄SPF鸡胚，放入超净台，用75％酒精棉擦拭消毒后,用火焰消毒胚蛋，气室的部位朝上，用无菌镊子磕破蛋壳，换用新的无菌镊子取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5-1cm块状组织,然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗3次，胰酶溶液的体积是组织块的体积的3倍；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，胰酶溶液与组织块的体积比为5：1，轻晃4min使进行消化；5)分散：将步骤4)消化后得到的上清液用移液管转移至T225细胞瓶，吹打2min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的T225细胞瓶内加入含有10wt％胎牛血清的1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后更换培养基，传代培养，得到鸡胚成纤维细胞。本实施例中，每个鸡胚分离到的成纤维细胞可以传13个T225的细胞瓶。实施例3：一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取10日龄SPF鸡胚，放入超净台，用75％酒精棉擦拭消毒后,用火焰消毒胚蛋，气室的部位朝上，用无菌镊子磕破蛋壳，换用新的无菌镊子取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5-1cm块状组织,然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗3次，胰酶溶液的体积与组织块的体积相等；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，胰酶溶液与组织块的体积比为10：1，轻晃5min使进行消化；5)分散：将步骤4)消化后得到的上清液用移液管转移至T225细胞瓶，吹打3min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的T225细胞瓶内加入含有10wt％胎牛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取9‑11日龄SPF鸡胚，消毒，无菌操作取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5‑1cm块状组织；然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗，去除红细胞；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，轻晃混匀使进行消化；5)分散：吸取步骤4)消化后得到的上清液，转移至细胞瓶，吹打1‑3min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的细胞瓶内加入含有胎牛血清的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，24‑32h后更换培养基，传代培养，得到鸡胚成纤维细胞。

【技术特征摘要】
1.一种快速制备大量鸡胚成纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取鸡胚：取9-11日龄SPF鸡胚，消毒，无菌操作取出鸡胚；2)胰酶冲洗：将步骤1)取出的鸡胚剪成直径为0.5-1cm块状组织；然后加入0.25wt％胰酶溶液冲洗，去除红细胞；3)匀浆：无菌条件下使用匀浆机将步骤2)处理后的鸡胚粉碎匀浆至鸡胚组织块直径小匀1mm；4)消化：向步骤3)匀浆后的组织块中加入0.25wt％胰酶溶液，轻晃混匀使进行消化；5)分散：吸取步骤4)消化后得到的上清液，转移至细胞瓶，吹打1-3min，使细胞分散；6)培养：向步骤5)的细胞瓶内加入含有胎牛血清的培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，24-32h后更换培养基，传代培养，得到鸡胚成纤维细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，具体消毒步骤为：采用75vt％...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，徐家华，王新秋，孙贝贝，任常宝，谢小雨，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，广东温氏大华农生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44