一种松材线虫的快速制备方法技术

一种松材线虫的快速制备方法属于线虫制备技术领域，尤其涉及一种松材线虫的快速制备方法。本发明专利技术提供一种灵敏、快速的松材线虫的快速制备方法。本发明专利技术包括以下步骤。（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于线虫制备
，尤其涉及一种松材线虫的快速制备方法。
技术介绍
我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病，此后，该病在我国境内迅速扩散蔓延，危害日趋严重，现已在江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、陕西、香港及台湾等地区发生，发生面积达8.7万公顷，累计致死松树3,500多万株,因松材线虫病造成的直接经济损失已达25亿元，间接损失达250亿，使我国的松木资源、自然景观和生态环境遭受严重影响。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供一种灵敏、快速的松材线虫的快速制备方法。为实现上述目的，本专利技术包括以下步骤。（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。（2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用。（3）将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。作为一种优选方案，本专利技术所述消毒处理方法包括以下步骤。1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心1min。2）用1%的硫柳汞溶液消毒，无菌水洗涤3次。3）用硫酸链霉素和放线菌酮，4℃消毒过夜。4）无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心1min。6）重复步骤2）。7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养，待大量虫卵产生后收集虫卵。8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。9）用吐温和NaOH溶液收集虫卵。10）无菌水冲洗。11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。作为另一种优选方案，所述消毒处理方法包括以下步骤。1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min。2）用1%的硫柳汞溶液消毒30min，无菌水洗涤3次。3）用0.1%的硫酸链霉素和0.02%的放线菌酮，4℃消毒过夜。4）无菌水冲洗3次后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min。6）重复步骤2）。7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的0.9%的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养12-24h，待大量虫卵产生后收集虫卵。8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。9）用0.05%的吐温和8mM的NaOH溶液收集虫卵。10）无菌水冲洗5次。11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。本专利技术有益效果。本实验采用PCR方法检测消毒效果可弥补传统培养方法的缺点，结合对线虫和虫卵进行多步消毒的方法，建立了获得无菌线虫的技术。与传统培养检测的方法相比，PCR方法检测细菌污染更灵敏更快速。具体实施方式本专利技术包括以下步骤。（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫。将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。（2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法。其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹。在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上。加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h。由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中。关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用。（3）将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。所述消毒处理方法包括以下步骤。1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心1min。2）用1%的硫柳汞溶液消毒，无菌水洗涤3次。3）用硫酸链霉素和放线菌酮，4℃消毒过夜。4）无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心1min。6）重复步骤2）。7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养，待大量虫卵产生后收集虫卵。8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。9）用吐温和NaOH溶液收集虫卵。10）无菌水冲洗。11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。所述消毒处理方法包括以下步骤。1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min。2）用1%的硫柳汞溶液消毒30min，无菌水洗涤3次。3）用0.1%的硫酸链霉素和0.02%的放线菌酮，4℃消毒过夜。4）无菌水冲洗3次后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫。5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤3-4次，3000rpm离心1min。6）重复步骤2）。7）将6）中消毒的线虫放在装有无菌的0.9%的生理盐水的培养皿中，25℃生化培养箱中培养12-24h，待大量虫卵产生后收集虫卵。8）用无菌水冲洗培养皿，直至线虫去除干净，只剩皿底的虫卵。9）用0.05%的吐温和8mM的NaOH溶液收集虫卵。10）无菌水冲洗5次。11）将部分虫卵置于NA培养基上，检测消毒情况，其余的虫卵接种到长满灰葡萄孢的斜面上。以上内容是结合具体的优选实施方式对本专利技术作的进一步详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明，对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种松材线虫的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10‑14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用；（2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10‑15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用；（3）将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。

【技术特征摘要】
1.一种松材线虫的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用；
（2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中，备用；
（3）将收集到的松材线虫及虫卵进行消毒处理。
2.根据权利要求1所述一种松材线虫的快速制备方法，其特征在于所述消毒处理方法包括以下步骤：
1）收集到的松材线虫分别用无菌的M9溶液洗涤，离心1min；
2）用1%的硫柳汞溶液消毒，无菌水洗涤3次；
3）用硫酸链霉素和放线菌酮，4℃消毒过夜；
4）无菌水冲洗后回接到长到半皿的灰葡萄孢菌上，培养1-2天，时刻观察，待有少量虫卵产生时，无菌水冲洗收集线虫；
5）将重新收集的线虫用无菌的M9溶液洗涤，离心1min；
6）...

【专利技术属性】
技术研发人员：申茂军，
申请(专利权)人：申茂军，
类型：发明
国别省市：辽宁;21